霍山石斛内生真菌DHS-3、DHS-4代谢产物的高效液相研究

陈传平，柯 成，陈乃东

（1.皖西卫生职业学院，安徽 六安 237005；2.皖西学院 生物与制药工程学院，安徽 六安 237012）

霍山石斛（Dendrobium huoshanenseC.Z.Tang et S.J.Cheng），兰科石斛属，多年生草本类植物，俗名米斛，主要分布于大别山区[1]。霍山石斛含有多糖、生物碱和黄酮等有效活性成分[2]，具有抗氧化、延缓人体衰老、增强身体免疫力等药理作用，是安徽省道地珍稀濒危药材之一[3]。

近年，野生霍山石斛产量日益减少，资源匮乏，难以满足市场需求，人工组培石斛虽然弥补了野生石斛的产量不足，但药效成分相比野生石斛有所差异[4]。根据近几年的研究，组培获得的霍山石斛试管苗与野生霍山石斛相比，缺少内生真菌是出现差异成分的重要因素[5]。很多药用植物的内生真菌的代谢产物与其宿主植物产生的代谢产物相同或类似[6]，内生真菌以及该菌的代谢产物研究已经成为寻找药物活性成分、保护濒危药用植物的重要途径之一[7]。本实验以已经分离得到的霍山石斛内生真菌进行培养，运用高效液相色谱（HPLC）检测技术对霍山石斛内生真菌的代谢产物进行分析，探究霍山石斛内生真菌的代谢产物中是否有与霍山石斛的成分相同的物质，为霍山石斛的资源保护与开发利用提供依据。

1 材料和试剂

1.1 仪器设备

高效液相色谱仪：Lanb4000 HPLC 色谱仪；KQ-300DE 数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；HH-4C数显恒温水浴锅（常州普天仪器制造有限公司）；YGH-500S/BS 远红外快速恒温干燥箱（上海跃进医疗器械有限公司）；CHA-S气浴恒温振荡器（金坛市杰瑞尔电器有限公司）；FD-1A-50冷冻干燥机（北京博医康实验仪器有限公司）；等。

1.2 试剂和原料

葡萄糖（AR，中国国药集团有限公司北京分公司），甲醇、乙腈、石油醚（色谱纯，阿拉丁公司）。

霍山石斛，2017 年3 月购自安徽省霍山县霍山石斛栽培基地，由植物细胞工程安徽省工程技术研究中心陈乃富教授鉴定为霍山石斛（DendrobiumhuoshanenseC.Z.Tang et S.J.Cheng）；霍山石斛内生真菌DHS-3、DHS-4，由皖西学院生物与制药工程学院陈乃东教授课题组提供。

2 研究方法

2.1 霍山石斛甲醇提取物的制备

2.1.1 霍山石斛材料处理

新采集的霍山石斛鲜条，纯净水洗净，剪碎，置70℃烘干箱中烘干至恒重，粉碎，过40 目筛，-80℃冷冻待用。

2.1.2 霍山石斛甲醇提取物的制备

称取霍山石斛冻干粉1.0g，置100mL 圆底烧瓶中，加入甲醇50mL，80℃冷回流提取3h，重复3 次，合并提取液，减压浓缩即得霍山石斛甲醇提取物。

2.2 内生真菌次生代谢产物的制备

2.2.1 培养基的制备

制备液体马铃薯培养基（PDA）：称取去皮土豆200.0g，切成块状，加入H2O800.0mL，煮沸并维持20min，降温后用四层纱布将溶液过滤，收集滤液。滤液中逐次加入葡萄糖20.0g、KH2PO43.0g、MgSO4·7H2O1.5g，搅拌均匀移入1000mL 三角烧瓶中，调节pH 至 7.0，定容至 1000mL 后，逐次倒入 34 个 150mL三角烧瓶中（每瓶大约分装30mL），瓶口添加棉塞，标记，置于高压蒸汽灭菌锅内灭菌，冷却后无菌检查合格即可待用。

2.2.2 内生真菌的培养

在超净工作台中，打开待用PDA 培养基，将挑有DHS-3、DHS-4的接种环在液体表面的瓶内壁上用力震荡，使菌体分散进入PDA中，所得即为种液；在三角烧瓶上分别标记为DHS-3A、DHS-3B、DHS-4A、DHS-4B，置于摇床中（气浴恒温振荡器、温度28℃、转速160-180r/min）活化培养24-48h。

活化培养结束，将三角烧瓶中的培养液用移液器移取1mL 转接到新的PDA 中，以经相同处理、不接种的培养基为空白对照，同条件培养4-5d 后，-80℃冷冻干燥至恒重，粉碎，过40目筛，待用。

2.2.3 次生代谢产物的制备

称取DHS-3、DHS-4发酵液冻干粉各1.0g，分别置100mL 圆底烧瓶中，加入甲醇50mL，80℃冷回流提取3h，重复3次，合并提取液，减压浓缩即得DHS-3、DHS-4甲醇次生代谢产物提取物。

2.3 检测样品的制备

样品用石油醚反复萃取5 次，合并萃取液后70℃挥干，称取样品质量，再用甲醇溶解，有机滤头过滤，收集到样品瓶内，计算浓度并贴上标签，待检测。

2.4 色谱条件

经过反复预实验，确定色谱条件为：色谱柱：AgilentSB-C18 4.6×150nm，5μm；上样量：20μL；流速：1mL/min；检测波长：280nm；柱温：30℃；流动相：乙腈-0.04%磷酸水溶液[8]。

2.5 数据处理

实验样品检测完毕，应用“中药色谱指纹图谱相似度评价系统A 版”评估软件，寻找相似的洗脱峰，确定共有峰、保留时间、相似度分析等相关图谱数据。

2.6 方法学考察

2.6.1 稳定性试验

每次吸取20μL 同一样品溶液，每隔6h 进样一次，共4 次，将所得图谱通过软件比对分析，结果如表1所示。

2.6.2 重复性试验

每次吸取20μL 同一样品溶液，依次上样4 次，将所得图谱通过软件比对分析，结果如表1所示。

表1 检测图相似度数据

3 结 果

3.1 DHS-3图谱分析

图1 为DHS-3 与霍山石斛甲醇提取物的HPLC检测图谱。

图1-A为DHS-3与空白对照检测图谱，比对后可发现，DHS-3 检测图谱上的RT100.47min、RT119.02min时的2个洗脱峰在图谱上均存在，且峰的分离效果比较好，故在进行DHS-3检测图谱与霍山石斛检测图谱比对过程中，应该将这2 个洗脱峰去除。

在图1-B中，将DHS-3检测图谱与霍山石斛检测图谱对比可以发现，RT18.353min、RT48.536min时的2 个洗脱峰在图谱上均存在，且峰的分离效果比较好，在与空白对照的过程中也没发现相应时间段出现洗脱峰，故可确定这2 个峰是DHS-3 的代谢产物与霍山石斛的共有产物。

图1 DHS-3与霍山石斛HPLC检测图谱

3.2 DHS-4图谱分析

图2 为DHS-4 与霍山石斛甲醇提取物的HPLC检测图谱。

在图2-A中，将DHS-4检测图谱与空白对照图谱比对后可发现，DHS-4检测图谱上RT100.47min、RT119.02min 时的2 个洗脱峰在图谱上均存在且峰的分离效果比较好，故在进行DHS-4检测图谱与霍山石斛检测图谱比对过程中，应该将这2 个洗脱峰去除。

在图2-B中，将DHS-4检测图谱与霍山石斛检测图谱经过对比可以发现，RT29.442min、RT50.358min时的2个洗脱峰在图谱上均存在，且峰的分离效果比较好，而且在与空白对照的过程中也没发现相应时间段出现洗脱峰，故确定这2 个峰是DHS-4的代谢产物与霍山石斛的共有产物。

图2 DHS-4与霍山石斛HPLC检测图谱

3.3 结论

根据霍山石斛内生真菌DHS-3、DHS-4代谢产物的HPLC 检测图谱分析可知，洗脱峰RT18.353、RT48.536，RT29.442、RT50.358 分 别 为 DHS- 3、DHS-4 两种菌的代谢产物与霍山石斛的共有峰。综上所述，霍山石斛内生真菌DHS-3、DHS-4 可能产生与霍山石斛相同的物质。

4 讨 论

植物内生真菌是指其生活史中某一阶段或整个阶段生活在生长健康的植物组织或细胞内，并对宿主细胞没有明显病害状况的一类真菌[9]。研究表明，植物内生真菌与其宿主在长期进化过程中存在互生互惠的关系，能产生与宿主相同或者相似的化学成分[10]。霍山石斛种子萌发和植株的生长发育都需要依赖与之共生的内生真菌[11]。本实验采用HPLC 法，对霍山石斛内生真菌 DHS-3 与 DHS-4 发酵产物甲醇提取物进行分析，根据检测图谱比对，从内生真菌发酵产物中发现内生真菌源霍山石斛的某些化学成分，为进一步采用真菌发酵而获得霍山石斛化学成分、降低对原药材的依赖、保护濒危药用植物霍山石斛资源提供可行思路。

本实验虽然实现了霍山石斛内生真菌发酵产物的较好分离，并在DHS-3、DHS-4 发酵产物中均发现内生真菌源霍山石斛可能的化学成分，但受到目前对霍山石斛及其内生真菌的认知局限，尚并不能确定HPLC 谱中共有组分峰的具体化学成分[12]及该共有峰是否为霍山石斛的主要活性来源[13]，需进行进一步实验加以深入研究。