超声协同次氯酸钠杀灭腐败菌效果与动力学研究

迟 媛 弓 敏 马艳秋 迟玉杰

(1.东北农业大学工程学院， 哈尔滨 150030； 2.东北农业大学食品学院， 哈尔滨 150030)

0 引言

食品原材料的清洗杀菌是食品加工中必不可少的环节，采用有效的杀菌方法可杀灭腐败菌和致病菌，以保证食品质量安全。存在于食品中的微生物种类繁杂，其中大肠埃希氏菌是食品中重要的腐生菌，能发酵多种糖产酸、产气，造成食品腐败变质，而且大肠杆菌产生的肠毒素、外毒素、志贺毒素、黏附素等致病物质会增加人体患病风险[1-2]；芽孢杆菌属已被证实为多种食品中常见的食品腐败菌，其中枯草芽孢杆菌可分解食品中蛋白质、糖类等营养物质，造成食品的风味和口感产生不期望的变化，从而引起食品的腐败变质[3]；考克氏菌广泛存在于海洋食品、腐乳、肉类等蛋白质含量高的产品中，同样极易造成食品的变质[4]。因此，对食品中典型腐败菌种进行有效的杀灭是保证产品质量安全的关键所在。

化学杀菌剂杀菌操作简便、成本低，目前国外食品加工企业一般采用次氯酸钠杀菌剂对蛋源进行杀菌处理，但是其单独作用于菌体细胞时，渗透性较差，对菌体仅造成亚致死损伤，杀菌效果差[5]。超声作为一种新型的非热杀菌技术被广泛应用，在食品加工中一般以液体为介质，作用过程产生空化效应，破坏菌体细胞结构，使微生物细胞处于亚损伤状态，但是单独作用时低强度下杀菌效果不明显，需要大幅度增加超声强度来提高杀菌效果，易造成能源的浪费。因此，将超声与化学杀菌剂联合作用会大幅度提高杀菌效果[6-7]。国内外研究者对超声协同化学杀菌剂产生的强化杀菌效应进行了研究，文献[8]研究发现，超声和臭氧共同作用对单增李斯特菌的杀菌效果比单一杀菌技术提升约30%；文献[9]研究发现，万古霉素和超声协同作用会显著提高对葡萄球菌的杀菌效果；文献[10]研究发现，超声会显著提高戊二醛对孢子悬浮液的杀灭效果；文献[11]研究发现，超声结合牛至精油对生菜中大肠杆菌O157:H7的杀菌比单一牛至精油杀菌效果提高了26%。

微生物杀菌效果的动力学模型是研究杀菌技术的关键理论之一，对其实际应用具有理论指导意义[12-13]。目前，关于超声协同化学杀菌剂的研究多数集中在证明二者之间的协同效应，对其协同杀菌动力学过程缺乏详细研究。本文以食品中常见的3株典型菌种为模型菌，研究超声协同次氯酸钠对模型菌的杀菌效果，采用一级动力学、Weibull、Logistic模型拟合杀菌动力学曲线，并对模型拟合度进行定量评价，利用生物电镜观察菌种微观结构破坏情况，并测定杀菌处理后3种指示菌细胞内物质的损失，以期为微生物杀菌提供重要的方法依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

指示菌：大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、考克氏菌(K.marina)，为实验室保存菌种。

培养基及化学试剂：伊红美蓝培养基、平板计数培养基，青岛海博生物科技有限公司；次氯酸钠(NaClO)溶液，天津市凯通化学试剂有限公司。中和试剂：5 g/L的硫代硫酸钠溶液，天津市天力化学试剂有限公司。戊二醛固定液，北京华越洋生物科技有限公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

KQ3200DE型数控超声清洗器，昆山市超声仪器有限公司；DHP-9272型电热恒温培养箱，上海齐欣科学仪器有限公司；核酸蛋白分析仪，北京维欣仪奥科技发展有限公司。S-3400 N(HITACHI)型扫描电镜，日本Giko公司。

1.3 方法

1.3.1菌悬液的制备

将斜面保存的E.coli、B.subtilis、K.marina取出，并分别加入2 mL质量分数为0.85%的灭菌生理盐水，将菌苔充分洗涤并吸取1 mL菌悬液到带有玻璃珠的三角瓶中，加入质量分数为0.85%的无菌生理盐水进行稀释并振荡30 min，将菌苔打碎，用核酸蛋白分析仪测定细胞浓度，调整菌悬液菌体浓度至107cfu/mL。

1.3.2悬液定量杀菌试验

参照GB 15981—1995中悬液定量的方法评价化学消毒剂的杀灭效果，用灭菌蒸馏水将10 g/L的NaClO溶液稀释成质量浓度为50、100、200 mg/L，吸取4.5 mL的NaClO溶液于灭菌试管中，加入0.5 mL菌悬液，混匀，并超声处理，设置超声功率60、120、150 W，超声时间60、90、120、150、180 s。杀菌处理后，同时取0.5 mL菌液加入到4.5 mL的中和试剂内终止消毒剂继续杀菌，中和10 min，采用平板计数法对不同杀菌条件下的残留活菌数进行计数。利用杀菌处理前后样品微生物残存率对数值表示超声协同NaClO致死效果(致死率C为负数，其绝对值越大表示致死效果越强)，空白组为不经过超声处理(即单独次氯酸钠杀菌处理)，试验重复3次，致死率计算公式为

(1)

式中N0——超声辅助次氯酸钠杀菌前细菌菌落菌体浓度，cfu/mL

N——超声辅助次氯酸钠杀菌后细菌菌落菌体浓度，cfu/mL

1.3.3微生物杀菌动力学模型

微生物杀灭效果的动力学模型是研究杀菌技术的关键理论，对其实际应用具有重要的理论指导意义。本研究选用一级动力学、Weibull、Logistic模型对超声协同次氯酸钠对3种典型菌株的杀菌动力学过程进行拟合并对3种模型进行比较分析。

(1)一级动力学模型

一级动力学模型的使用是假设微生物具有相同的抗逆性，随时间的变化微生物下降的对数值呈现线性变化[14]，模型公式为

(2)

式中t——杀菌处理时间，s

Dp——指数递减时间，即某处理条件下每杀死90%的活菌数所需时间，s

(2)Weibull模型

Weibull模型用于描述各种线性和凹凸型曲线的非线性模型[15-16]，该模型假设菌体对杀菌强度的抗性具有差别且符合Weibull模型分布，文献[17]研究发现Weibull模型能够较好地拟合微酸性电解水与苯扎氯铵联合温和热处理对蜡样芽孢杆菌的杀菌动力学过程，本研究在Hussain基础上做了简化处理，公式为

(3)

式中a——规模参数，表示一定条件下降低一个对数级细菌所需时间

b——形状因子，当b<1时曲线向上凹；b>1时曲线向下凹；b=1时为一条直线

(3)Logistic 模型

Logistic模型假设菌体对杀菌强度的抗性具有差别，文献[18]发现该模型能够很好地拟合微波对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的杀菌动力学过程，本研究在文献[18]基础上做了简化处理，公式为

(4)

式中p——最低的残存细菌菌落菌体浓度对数值

q、m——曲线方程的参数

(4)模型评价

Af、Bf、R2和均方根误差4个参数通常作为一种定量的方法来评价模型[19]，Af是精确因子，表示预测值与实测值偏离程度。Bf是偏差因子，Bf>1表示模型预测值比实测值高；Bf<1表示模型预测值比实测值低；当Bf越接近1，模型拟合度越高；均方根误差和R2均表示模型的精确度、可靠度，当R2越接近于1，均方根误差越小，模型拟合度越好。

1.3.4扫描电镜观察

将3株菌种的单菌落分别接入液体培养基中，培养48 h，取出。将含有菌株的液体培养基加到已灭菌的10 mL离心管中，8 000 r/min离心3 min，弃掉上清液，加入质量浓度为200 mg/L的次氯酸钠溶液5 mL，同时置于超声体系，超声强度150 W，时间120 s。加入等量中和剂终止杀菌，离心10 min，弃掉上清液，加入无菌生理盐水进行洗脱2次，转移到1.5 mL的离心管内，得到灭菌处理过后的菌泥，加入戊二醛固定液于4℃条件下固定2 h。用磷酸盐缓冲液冲洗3次，每次10 min；然后采用50%、70%、90%、100%的乙醇进行逐级脱水各1次，每次10 min；采用1∶1的100%乙醇/叔丁醇进行置换10 min；临界点干燥、喷金，电镜下观察、拍照，获得电镜结果图，未经杀菌处理的对照样本作同样处理。

1.3.5细菌细胞内物质损失的测定

参照文献[20]的方法对杀菌前后3种菌株菌悬液中可溶性蛋白及还原糖含量进行测定，取经过超声处理、超声联合次氯酸钠、单独次氯酸钠杀菌处理后的3种菌株的菌悬液，各吸取2 mL菌液至乳糖胆盐培养基中，37℃恒温培养，每隔1 h取出，在7 000 r/min下离心10 min，取上层清液采用直接滴定法测定杀菌前后菌悬液中的还原糖含量。采用牛血清蛋白浓度-吸光度标准曲线法测定可溶性蛋白含量，同样取杀菌后的菌悬液样品2 mL，在-20℃冰箱中冷冻12 h，加入0.01 mol/L Tris-HCl (pH值8.0)缓冲液，准确吸取0.1 mL各处理样品于10 mL具塞试管中，加入5 mL考马斯亮蓝G 250染色剂，混合后放置2 min，并于波长595 nm处测定吸光度，从标准曲线查得相应样品的蛋白含量。

1.4 试验数据处理及分析

应用SPSS Statistics 19.0软件对试验数据进行方差分析，采用Origin软件作图，使用Curve Expert进行模型拟合。

2 结果与分析

2.1 超声协同次氯酸钠溶液的杀菌效果

次氯酸钠具有强氧化性，属于一种安全高效消毒液，被广泛应用于食品原料的清洗杀菌过程中。研究发现次氯酸钠溶于水后水解形成次氯酸，次氯酸能够穿透菌体细胞壁并进一步破坏蛋白质及酶系统，影响细胞生命活动从而杀死微生物[21]。本研究选用60、120、150 W超声与50、100、200 mg/L的次氯酸钠联合作用，研究超声协同次氯酸钠溶液对E.coli、K.marina、B.subtilis杀灭效果，杀菌动态曲线如图1所示。

图1 超声协同次氯酸钠对3种指示菌的杀菌效果Fig.1 Effect of different ultrasonic treatments assisted sodium hypochlorite on inactivation of indicator bacteria

由图1可知，E.coli、K.marina、B.subtilis的致死量随NaClO质量浓度的增加而不断增加，且不同质量浓度的NaClO对3种指示菌的致死量具有显著差异(P<0.05)。当NaClO质量浓度达200 mg/L，单独杀菌180 s后，菌悬液中E.coli、K.marina、B.subtilis致死率为(-3.83±0.134)、(-3.79±0.122)、(-2.38±0.136)个对数值，由此可见E.coli对NaClO的抗性较低，K.marina次之，而B.subtilis对NaClO具有较强的抗性，文献[22]也研究了NaClO对E.coli和B.cereus的杀菌效果，研究结果得出当NaClO质量浓度为100 mg/L时对E.coli的损坏程度较大，而对B.cereus的杀菌较弱，与本研究结果相一致，这可能是由于具有芽孢结构的菌株对NaClO消毒液具有较强的抗性，加之菌体外层具有一层生物膜，NaClO难以渗透进入菌体内部，导致NaClO对芽孢杆菌的杀灭能力较弱[23-24]。同样，文献[25]研究了氯、二氧化氯和过氧乙酸对B.cereus孢子结构的杀菌效果，发现该菌株对3种化学杀菌剂具较强的抗性，需要湿热条件对其进行联合杀菌，才能达到良好的杀菌效果。

在NaClO质量浓度相同的情况下，不同功率的超声协同NaClO杀菌，随处理时间的增加，对E.coli、K.marina、B.subtilis的致死量逐渐增大。当NaClO质量浓度为200 mg/L，超声150 W处理180 s时，对E.coli的致死率绝对值为(4.54±0.164)个对数值，对K.marina和B.subtilis的致死率绝对值分别为(4.28±0.123)、(3.97±0.134)个对数值，较相同NaClO浓度单独处理相同时间相比致死量显著提高，提高了13%～67%。此外，处理时间相同、NaClO质量浓度相同的情况下，对3种菌的致死量随超声强度的增强而增加，且高强度的超声对低强度的超声的协同杀菌效果显著增加(P<0.05)。当NaClO质量浓度为50、100、200 mg/L，超声功率60 W，处理时间60～180 s，对比未经过超声处理的杀菌量不存在显著差异(P>0.05)；当超声功率为150 W时，对比超声功率60 W，相同时间对3种指示菌的致死效果显著增加。相似地，文献[26]研究了超声波辅助二氧化氯对鸡蛋表面大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的杀灭效果，研究得出59 kHz超声协同50 mg/L二氧化氯，处理5 min，对3个菌种的杀菌量达4个对数值，与本研究得出相同的规律，即超声波会显著提高杀菌剂的杀菌效果，可能是协同作用时超声波优先作用于菌体生物被膜结构，通过强烈的空化效应破坏生物被膜三维结构使内部菌体暴露，导致细菌通透性增加，菌体蛋白质及DNA渗漏，代谢酶活性降低，杀菌剂便可直接作用于裸露的菌体，强化杀菌效应[27-29]。文献[30]做了前期工作，采用160 W的超声波和5～62℃的热处理联合使用，发现比二者单独使用具有更好的杀菌效果，且处理时间短，耗能少。文献[31]研究同样得出超声在微生物杀菌过程中与其他灭菌技术联合效果更好，如热处理，氯化作用，加压条件下等。

2.2 超声协同次氯酸钠溶液杀菌效果动力学分析

运用一级动力学、Weibull、Logistic模型对超声协同NaClO对E.coli、K.marina、B.subtilis的灭活动力学曲线进行拟合，其拟合模型参数如表1～3所示。

表1 3种模型拟合超声协同次氯酸钠对E.coli致死效果的动力学模型参数Tab.1 Kinetic curve parameters of three models fitting lethal effect of ultrasound combined with sodium hypochlorite on E. coli

表2 3种模型拟合超声协同次氯酸钠对K.marina致死效果的动力学模型参数Tab.2 Kinetic curve parameters of three models fitting lethal effect of ultrasound combined with sodium hypochlorite on K. marina

表3 3种模型拟合超声协同次氯酸钠对B.subtilis致死效果的动力学模型参数Tab.3 Kinetic curve parameters of three models fitting lethal effect of ultrasound combined with sodium hypochlorite on B. subtilis

决定系数一般用来对模型拟合程度做一个总体评价[32]，由表1～3可知，采用一级动力学模型拟合获得不同杀菌处理条件下的直线，其部分决定系数R2小于0.95，尤其当NaClO质量浓度及超声强度增大后线性拟合效果较差。而利用Weibull模型拟合的动力学曲线，其R2均大于0.95。Logistic模型对高强度的超声体系协同NaClO的杀菌动力学曲线进行拟合，R2在0.90～0.95之间。一级动力学模型认为微生物残留菌数量与时间呈现线性关系[33]，而本研究发现超声协同NaClO杀菌更符合非线性模型，在超声功率及NaClO质量浓度较低的情况下的杀菌动力学过程中Weibull模型和Logistic模型均可以很好地拟合动力学曲线，随超声功率及NaClO质量浓度的增加，Weibull模型更加符合杀菌过程。因此，超声协同NaClO对3种典型菌株的杀菌过程更加符合Weibull模型。

2.3 模型拟合度评价

为了进一步比较Weibull模型和Logistic模型对超声协同NaClO杀菌过程的拟合度，进一步比较分析了模型评价参数Af、Bf、均方根误差和R2。由表4可知，Weibull模型的Af和均方根误差均低于Logistic模型，说明Weibull模型预测的平均精确度较高，离散程度较低，同时Weibull模型的Bf和R2较Logistic模型更接近于1。因此，Weibull模型从整体上能够很好地拟合超声协同NaClO的杀菌动力学过程。

表4 数学模型评价参数的比较Tab.4 Comparison of evaluation indices of mathematics model

通过比较Weibull模型和Logistic模型回归方程所得预测值和实测值的接近程度，以实测数据为横坐标，模型预测数据为纵坐标作图，利用线性拟合得到的相关性方程及决定系数R2来判断预测值和实测值的差异。由图2可知，Weibull模型和Logistic模型对超声协同NaClO对3种典型菌株致死率的预测值与实测值之间具有较好的相关性。线性相关方程的斜率及截距越接近于0，R2越接近于1，表明模型拟合效果越好。Weibull模型对E.coli、K.matina、B.subtilis杀菌拟合得到的方程分别为y=1.002 52x+0.007 36、y=0.994 97x-0.021 13、y=0.990 0x-0.003 6，对应的决定系数分别为0.983 8、0.985 8、0.985 3；Logistic模型拟合得到的方程分别为y=0.996 99x+0.046 92、y=0.985 78x-0.007 16、y=1.003 1x+0.015 2，对应的决定系数分别为0.965 3、0.963 6、0.964 4。因此，Weibull模型较Logistic模型能够较好地模拟超声协同NaClO杀菌的动力学过程。

图2 超声协同次氯酸钠溶液杀菌效果预测值和实测值的相关性Fig.2 Correlation between observed and predicted values for inactivation effects of sodium hypochlorite combined with ultrasonic treatment

2.4 Weibull模型参数与超声强度的关系分析

通过比较得出Weibull模型较线性模型和Logistic模型能够很好地拟合超声协同次氯酸钠的杀菌动力学过程。参数a可以反映杀菌的效果[34]，由图3和表5分析得出，参数a与超声强度具有很好的负相关，R2均不小于0.917。模型公式中形状参数b与超声强度呈现较好的负相关，R2均不小于0.852，b值随超声强度的增加逐渐减小，且较高强度的超声协同作用下参数b均小于1，参数b反映的是曲线形状，说明曲线拖尾明显，在同一超声强度作用下，延长杀菌时间并不一定能够显著提高杀菌效果，而且由相关研究同样证明超声强度增加到一定程度后，其空化效应会减弱，杀菌率也会趋于平缓，与其他相关研究结果一致[35]。

表5 相关性方程Tab.5 Correlation equation

图3 Weibull模型参数a和b与超声强度的关系Fig.3 Correlation between Weibull model parameter a or b and ultrasonic intensity

2.5 超声协同次氯酸钠的杀菌机理分析

2.5.1扫描电镜观察结果

为了进一步探究超声协同NaClO对3种典型菌株细胞菌体破坏情况，本研究利用生物扫描电镜对超声协同NaClO及单独NaClO处理前后E.coli、K.matina、B.subtilis的微观结构进行观察，结果如图4所示。

由单独NaClO溶液及超声协同NaClO溶液杀菌处理前后3种指示菌扫描电镜结果(图4，放大倍数2 000～3 500)，可以看出3种菌株杀菌前后菌体形态结构的变化。未经杀菌处理的E.coli(图4a)呈现规则的长杆状，菌体胞壁周围完整，轮廓清晰，胞质均匀；K.marina(图4d)表现为球形，胞壁光滑完整，轮廓清晰，胞质均匀；B.subtilis为规则的梭形，胞壁光滑完整，且细胞壁与细胞膜之间无间隙，胞质均匀饱满。

图4 超声协同次氯酸钠对指示菌处理前后的扫描电镜图Fig.4 SEM photos of indicator bacteria before and after treatment with ultrasound combined with sodium hypochlorite

由图4b、4e、4h可知，经过NaClO单独处理后3种指示菌菌体塌陷，原生质溶出，其中E.coli菌体中部凹陷严重且存在部分细胞碎片，K.marina细胞壁裂解，细胞皱缩，B.subtilis表现严重的皱缩现象，细胞质损失严重。而超声协同NaClO处理后，3种指示菌菌体破坏大，其中E.coli形态变化最为严重(图4c)，多数菌体已呈现碎片状态，K.marina细胞壁破裂崩解，胞质溶出，B.subtilis菌体表面起皱，胞质溶出并向外渗出，细胞发生严重皱缩且残存少部分细胞碎片。关于菌体杀菌机理目前多数研究学者认为细菌的死亡是通过破坏菌体细胞壁使菌株内部结构暴露，引起菌体对外界环境的抗性降低，进而在杀菌条件下致使其死亡[36-38]。超声协同NaClO会加速菌体裂解死亡，可能原因是在杀菌过程中超声优先作用于菌体细胞壁，破坏了菌体外层结构，NaClO便直接作用于裸露的菌体，加速菌体细胞死亡。文献[39]建立了超声波产生的剪切力造成微生物表面附近塌陷的模型，进一步阐明了超声波能够破坏菌体外层结构，此外，文献[40]关于超声波的杀菌机制进行了阐释，认为超声产生的空化效果，即微泡的形成、生长和溃灭导致机械效应，进而破坏菌体结构。

2.5.2细菌细胞内物质损失

为了进一步研究超声协同NaClO对3种典型菌株菌体的破坏情况，测定并比较了超声协同NaClO和单独NaClO杀菌处理前后细菌细胞内物质损失情况，其中单独NaClO溶液处理条件为200 mg/L、2 min，超声协同NaClO处理条件为150 W、200 mg/L、180 s，结果如图5所示。

图5 超声协同次氯酸钠杀菌对细菌细胞内物质损失的影响Fig.5 Effect of ultrasonic assisted sodium hypochlorite sterilization on loss of intracellular material of bacteria

由图5可知，经过杀菌处理的3种菌株菌悬液中还原糖及可溶性蛋白质均出现增加的现象，超声联合NaClO杀菌处理较单独NaClO杀菌，菌悬液中还原糖及可溶性蛋白质含量显著增加，还原糖及可溶性蛋白质含量均增长了近30%，尤其以E.coli菌悬液最为明显，还原糖含量(质量比)及可溶性蛋白质含量(质量浓度)分别达到0.76 g/(100 g)、57.36 mg/mL。由此可见，超声协同NaClO会极大地损伤菌体细胞膜，进而改变细胞膜通透性，使菌体中可溶性蛋白质及还原糖渗出，加速了菌体死亡，与扫描电镜结果相一致。

3 结束语

超声协同NaClO对3种典型菌种的致死起到了一定的协同作用，且表现为高强度的超声功率(60 W以上)能够显著提高NaClO的杀菌效果，在超声功率150 W、NaClO质量浓度200 mg/L、作用时间180 s的条件下对大肠杆菌、考克氏菌、枯草芽孢杆菌的杀菌量分别为(4.54±0.164)、(4.28±0.123)、(3.97±0.134)个对数值，对比单独NaClO的杀菌量提高了13%～67%。对其杀菌效果动力学过程进行分析得出，与一级动力学模型和Logistic模型相比，Weibull模型整体上能更好地拟合超声协同次氯酸钠对大肠杆菌、考克氏菌、枯草芽孢杆菌的失活动力学过程。通过观察超声协同次氯酸钠对3种典型菌株微观结构的变化发现，超声协同次氯酸钠会破坏菌体细胞壁，导致质壁分离，细胞膜结构被破坏，从而导致细胞质外溢，促使胞质内部还原糖及蛋白质等物质渗出，部分细胞器溶解及细胞皱缩，最终致使细胞死亡。该研究可为超声协同次氯酸钠广泛用于微生物杀菌提供方法依据。