草原红牛Bcl2L13 的CDS 克隆及其在不同组织的表达规律研究

刘理想 ，高 一，秦立红,3,4，吕 阳，薛佳佳，吴 健,3,4，胡忠昌，张国梁,3,4*

（1.吉林省农业科学院畜牧分院，吉林公主岭 136100；2.吉林农业大学动物科学技术学院，吉林长春 130000；3.吉林坤成牧业科技发展有限公司，吉林公主岭 136100；4.吉林省肉牛繁育及养殖技术科技创新中心 吉林公主岭 136100）

草原红牛是我国成功培育的第一个肉乳兼用型优良品种，具有适应性强、耐粗饲的特点；屠宰率和净肉率分别达到56.5%和43.9%[1]；肉质鲜嫩，肌间脂肪沉积良好，大理石花纹等级平均为5 级，在国内属于优秀牛肉[2]。肌间脂肪沉积是体脂分配、血液脂质代谢、脂肪酸组成、脂肪代谢关键基因及转录调控因子等综合作用的结果[3]。因此探究脂肪代谢调控关键因子具有重要意义。

Bcl-2L13（Bcl-2-like Protein 13）基因是B 细胞淋巴瘤-2（Bcl-2）家族成员之一，定位于线粒体，是一种线粒体外膜蛋白[4]，于2001 年被Kataoka 等[5]研究发现在人的心脏、胰腺和胎盘组织中的mRNA 表达水平较高。Ju 等[6]研究报道，Bcl-2L13基因敲除导致米色脂肪细胞分化后脂质积聚减少，Bcl-2L13的转录被PPARγ激动剂罗格列酮上调，Bcl-2L13在体内由b3-肾上腺素激动剂CL-316、CL-243 刺激的白色脂肪组织褐变过程中以及在体外米色脂肪细胞分化过程中表达增加，表明Bcl-2L13可能是PPARγ介导的脂肪细胞重塑的关键效应因子。

氧化磷酸化是脂肪细胞分化过程中ATP 产生的主要机制，而成骨细胞使用糖酵解来满足ATP 需求[7]。Guntur 等[8]研究报道，小鼠前脂肪细胞系3T3-L1 分化过程中主要通过氧化磷酸化来满足ATP 需求。Fujiwara 等[9]研究报道，在小鼠前脂肪细胞系3T3-L1 和小鼠耳间充质干细胞（EMSCs）诱导分化中，Bcl-2L13基因敲除使油红O 染色减少，主成脂肪转录因子PPARγ的mRNA 表达量也减少，氧化磷酸化显著减少，糖酵解产生的ATP 显著增加，Bcl-2L13通过增加氧化磷酸化，抑制细胞凋亡，并通过有丝分裂调控线粒体进一步促进脂肪生成。因此，通过对Bcl-2L13基因与脂质代谢之间的关系进行探究，不仅能够对脂质代谢紊乱产生的各种疾病更加了解，而且为改善牛肉品质提供一定的理论参考依据，从而进一步提高养殖行业的经济效益。

最新研究表明，Bcl-2L13基因与脂肪生成有关，本试验研究随机挑选12 头18 月龄的草原红牛，通过对其血液DNA 提取和组织RNA 提取，以TA 克隆的方法完整地克隆了草原红牛Bcl-2L13基因的编码区，采用生物信息分析软件对克隆序列进行生物信息学分析，以实时荧光定量PCR 方法检测了该基因在草原红牛心脏、肺脏、脾脏等组织的表达差异，为进一步提高草原红牛牛肉品质提供参考资料。

1 材料和方法

1.1 实验材料 实验牛由吉林省农业科学院提供，随机挑选12 头18 月龄的草原红牛公牛，送至屠宰场屠宰，期间收集心、肝、脾、肺、肾脏等组织，液氮保存备用。

1.1 实验主要试剂、仪器 胶回收纯化试剂盒（Omega）、Trizol（Invitrogen）、小提质粒提取试剂盒（Axygen）、pMD18-T 载体（TaKaRa）、5×PrimeScript RT Master Mix（TaKaRa）、2×ES Taq Master Mix（CWBIO）、Light Cycler 480 SYBR GreenIMaste（Roche）、Quawell-Q5000超微量分光光度计（北京鼎盛）。

1.2 RNA 提取 Trizol 法提取心、肺、脾、肝、肾脏等各组织总RNA；用超微量分光光度计检测所提RNA 的浓度和OD260/280。

1.3 cDNA的制备 反转录体系为10 μL，其中5×PrimeScript RT Master Mix 添加量为2 μL；RNA 添加量为500 ng；然后用RNase-Free H2O 补足至10 μL。反转录程序：37℃15 min；85℃ 5 s。反应完毕，收集产物置于4℃保存备用。

1.5 引物设计与合成 利用Primer 5.0 软件设计牛Bcl-2L13基因（GenBank 登录号：NM_001078082.2）完整编码区的扩增引物；在Bcl-2L13核苷酸序列的编码区内设计实时荧光定量所需引物，实时荧光定量的管家基因为β-actin（GenBank 登录号：NM_173979），具体信息见表1。所设计的所有引物交由苏州金唯智合成。

表1 引物信息

1.6 PCR 扩增和TA 克隆 PCR 体系为50 μL，其中ddH2O水添加量为 20 μL，2×ES Taq MasterMix添加量为25 μL，F/R 引物添加量各为1.25 μL，cDNA 添加量为2.5 μL。反应程序：94℃ 5 min；95℃ 30 s；58℃ 30 s；72℃ 52 s；34 个循环，72℃ 5 min，置于4℃保存备用。琼脂糖凝胶电泳检测产物，凝胶浓度为1%。鉴定完毕后产物利用DNA 纯化回收试剂盒回收。TA 克隆：体系为10 μL；其中胶回收产物添加量为4 μL；solutionI添加量为5 μL ；pMD18-T 载体添加量为 1 μL。将以上试剂混匀4℃过夜，次日将连接产物与大肠杆菌DH5α感受态细胞按照1:10 的比例混匀，置于冰上30 min，然后放入42℃水浴锅90 s，再放置冰上3 min，然后加入无抗生素LB培养液800 μL，室温下置于摇床（200 g）复苏1 h，复苏结束后取200 μL 菌液涂板，平板为含氨苄青霉素（100 μg/mL）的LB 固体平板，涂好后置于37℃恒温培养箱中培养16 h。次日挑取8 份单菌落，然后加入到含氨苄青霉素的LB 培养液中混匀，室温下置于摇床（200 g）过夜。次日用质粒小提试剂盒提质粒，提取成功后以其为模板进行菌落PCR。将鉴定正确的菌液交由苏州金维智测序。

1.7 生物信息学分析 利用DNAStar 软件将测序结果与野猪（登录号：XM_003126595.6）、白鲸（XM_022577 139.1）、白豚（XM_007469525.1）、虎鲸（XM_004286 267.2）、宽吻海豚（XM_019926055.1）、普通牛（NM_001078082.2）、瘤牛（XM_019959968.1）、骆驼（XM_010964106.1）、牦牛（XM_014478065.1 ）、绵羊（XM_012175613.3）、人（NM_015367.4）、山羊（XM_0180 48707.1）、亚洲水牛（XM_025282917.1）、羊驼（XM_015244912.1）这些物种的Bcl-2L13基因mRNA 序列进行同源性比对，并用Megalign 构建系统进化树；利用DNAstar 将测序结果翻译为氨基酸序列；利用ExPASY 对Bcl-2L13 蛋白理化特性和蛋白亚细胞结构进行分析；利用ProtScale 对Bcl-2L13 蛋白亲疏水性进行分析；利用NetPlos2.0Server 软件对Bcl-2L13 蛋白进行磷酸化分析；利用DNAStar 软件预测Bcl-2L13 的蛋白二级结构；利用SWISS-MODEL 构建Bcl-2L13 蛋白质三级结构模型。

1.8 实时荧光定量PCR 以制备的各组织的cDNA 为模板，管家基因为β-actin，进行实时荧光定量PCR 反应。反应体系为20 μL，其中LightCycler 480 SYBR GreenI Maste添加量为10 μL ；ddH2O添加量为8 μL；F/R（10 μmol/L）添加量各位0.5 μL；cDNA 添加量为1 μL。反应程序：95℃ 5 min，95℃ 10 s，60℃ 15 s，72℃ 20 s，设置43个循环，95℃ 5 s，65℃ 1 min，升温速率5℃/s，从65℃递增到97℃，反应至40℃结束。

1.9 统计分析 采用2-△△Ct方法，收集实时荧光定量数据进行分析；数据统计采用GraphPad Prism 软件，数据以平均值±标准误表示，P＜0.05 为显著性判断标准。

2 结果

2.1Bcl-2L13基因的PCR 结果 以琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，凝胶浓度为1%。凝胶成像分析仪显示一条大小约2020 bp 的条带（图1），与理论扩增目的条带长度一致。

2.2Bcl-2L13基因同源性分析以及系统进化分析 草原红牛Bcl-2L13基因与普通牛、牦牛的同源性最高（100% 和99.3%），和瘤牛、亚洲水牛的同源性分别为91.8%、90.5%，与野猪、白鲸、白豚、虎鲸、宽吻海豚、骆驼、绵羊、人、山羊和羊驼的同源性较低，分别为61.7%、69.8%、74.0%、69.1%、64.8%、63.4%、88.2%、56.9%、88.0%、62.0%，具体结果见图2。由图3 可知，与草原红牛进化关系密切的是普通牛和牦牛，而亲缘关系最远的是虎鲸。

2.3 Bcl-2L13 蛋白理化性质 ExPASy 软件的具体分析结果见表2，Bcl-2L13基因编码279 个氨基酸，有39个带负电荷的氨基酸残基（Asp+Glu），16 个带正电荷的氨基酸残基（Arg+Lys）。Bcl-2L13 蛋白质分子式：C1348H2108N348O439S5，蛋白分子量是30.374 ku，pI为4.51。蛋白质不稳定指数为77.71，属于不稳定蛋白质。

2.4 Bcl-2L13 蛋白亚细胞结构定位 Target P 软件的具体分析结果见表3，Bcl-2L13 蛋白在线粒体中存在很少，较少地分布于分泌途径。PSORT II 软件的具体分析结果表明，Bcl-2L13 蛋白主要位于细胞质（65.2%）、内质网（4.3%）、过氧化物酶体（8.7%）、细胞骨架（4.3%）、线粒体（4.3%）及细胞核（13.0%）内有少量分布。

2.5 Bcl-2L13 蛋白亲水性、疏水性和磷酸化分析 Protscale软件的具体分析结果见图4，由图可知Bcl-2L13 蛋白总平均亲水性为-0.250，这一结果表明Bcl-2L13 蛋白属于水溶性蛋白。Net Phos3.1 软件的具体分析结果见图5，Bcl-2L13 蛋白共有33 个磷酸化位点（分值大于0.5），丝氨酸（Serine）20 处，苏氨酸（Threonine）9处，酪氨酸（Tyrosine）4 处。

2.6 Bcl-2L13 蛋白二级结构和三级结构预测 Bcl-2L13蛋白二级结构的预测采用DNAStar 软件，具体结果见图6，Bcl-2L13 蛋白蛋白二级结构主要形式包括22.4%的α-螺旋、12.1%的β-转角、31.0%的β折叠、34.5%的无规则卷曲。Bcl-2L13 蛋白三级结构的构建采用SWISS-MODEL（图7），与预测的二级结构形式相吻合。

2.7 实时荧光定量PCR 结果分析 对实时荧光定量PCR 所得数据进行分析，如图8 所示，以肺脏组织为对照，Bcl-2L13在背最长肌中表达量最高，在肺组织中表达量最少，，草原红牛Bcl-2L13基因在不同组织中的表达存在显著差异（除了脾脏和十二指肠），在心脏、背最长肌中极显著表达。

表2 草原红牛Bcl-2L13 蛋白的氨基酸组成

表3 Target P 分析结果

3 讨 论

Bcl-2L13基因是Kataoka 等[5]研究鉴定的一个新的广泛表达的Bcl-2 同源物，Bcl-2L13基因的BH 基序过表达对细胞活力影响小，而C-末端膜锚（MA）结构域的过表达导致多数细胞凋亡，BHNo 结构域过表达的细胞凋亡率略低于C-末端膜锚（MA），表明Bcl-2L13基因具有促细胞凋亡功能。Kim 等[10]研究报道，Bcl-2L13基因的MA 结构域缺失突变导致Bcl-2L13促细胞凋亡功能的消失。可知MA 以及BHNo 结构域是Bcl-2L13基因促细胞凋亡的关键部位，而BH 基序结构域可能参与其他生物学功能，如信号转导。Ju 等[6]研究报道，Bcl-2L13基因敲除导致米色脂肪细胞分化后脂质积聚减少，Bcl-2L13的转录被PPARγ 激动剂罗格列酮上调，Bcl-2L13在体内由b3-肾上腺素激动剂CL-316243 刺激的白色脂肪组织褐变过程中以及在体外米色脂肪细胞分化过程中表达增加，这些结果表明Bcl-2L13基因参与脂质代谢。本研究成功克隆出草原红牛Bcl-2L13基因，并利用一系列软件分析了Bcl-2L13 蛋白质的理化性质，预测了二级和三级结构。

本研究采用TA 克隆法，克隆了草原红牛Bcl-2L13基因的完整编码序列，长度为839 bp，编码279 个氨基酸，该蛋白分子质量为30.374 ku，理论等电点为4.51，总平均亲水性为-0.250，属于亲水性蛋白。Murakawa等[11]研究表明，小鼠Bcl-2L13基因编码含有434 个氨基酸的蛋白质，与草原红牛Bcl-2L13 分子量的差异初步分析与Bcl-2L13基因的低序列保守性有关。草原红牛Bcl-2L13的克隆序列与普通牛和牦牛的同源性高（100%和99.3%），符合生物进化特征，与野猪、白鲸、白豚、虎鲸、宽吻海豚、骆驼、绵羊、人、山羊和羊驼的同源性分别为61.7%、69.8%、74.0%、69.1%、64.8%、63.4%、88.2%、56.9%、88.0%、62.0%。亚细胞结构定位表明，Bcl-2L13 蛋白多位于细胞质中，分泌途径存在很少，这一结果与Yi 等[12]研究Bcl-2L13的剪接变体定位于细胞质与线粒体无关相一致。Nakazawa 等[4]研究表明，C-末端膜锚定区缺失的Bcl-2L13定位于细胞质，表明C-末端膜锚定区对Bcl-2L13定位于线粒体起关键作用。磷酸化位点分析发现，Bcl-2L13 蛋白存在33 个磷酸化位点、丝氨酸（Serine）20 处、苏氨酸（Threonine）9 处、酪氨酸（Tyrosine）4 处，说明该基因与许多酶作用和介导蛋白活性。这一结果与Kim 等[10]研究得出的Bcl-2L13 通过与腺嘌呤核苷酸转运体相互作用诱导细胞凋亡相符合。通过对草原红牛Bcl-2L13 蛋白质二级和三级结构的预测发现，该蛋白二级结构主要形式为无规则卷曲，部分为α-螺旋、β-转角、β折叠，蛋白质结构不稳定，这一结果也从侧面验证Bcl-2L13剪接变体的存在[12]。研究表明，Bcl-2L13基因编码的蛋白结构不稳定，具有与其他酶作用和介导蛋白活性的作用，继而影响脂肪代谢，但具体机制尚有待进一步探究。

实时荧光定量PCR 结果表明，Bcl-2L13在不同组织中的表达量存在明显差异，以肺脏组织为对照，Bcl-2L13在背最长肌中表达量最高，在肺组织中表达量最少。检测到Bcl-2L13在心脏中相对表达量也较高，这一结果与Aufiero 等[13]关于Bcl-2L13在心脏中的研究相一致。本研究探究了Bcl-2L13基因在草原红牛上的基本情况，为进一步研究Bcl-2L13基因对家畜脂代谢的影响提供资料。

4 结 论

本研究采用TA 克隆方法，克隆了草原红牛Bcl-2L13基因的完整编码序列，长度为839 bp，编码279个氨基酸，该蛋白分子质量为30.374 ku，属于水溶性蛋白，Bcl-2L13 蛋白共有磷酸化位点33 个（分值大于0.5）。Bcl-2L13 蛋白蛋白多位于细胞质中，分泌途径存在很少，其二级结构形式主要为无规则卷曲，部分为α-螺旋、β-转角、β折叠，蛋白质结构及其不稳定。实时荧光定量PCR 结果表明，Bcl-2L13在背最长肌中表达量最高，在肺组织中表达量最少，不同组织中Bcl-2L13的表达存在显著差异。