下调miR-9对LPS诱导的大鼠心肌细胞炎症因子分泌的影响和机制

李媛莉 赵继波 张三明

脓毒症是一种由于微生物感染而引起的宿主炎症损伤的相关疾病，脓毒症引起的心肌损伤是临床上常见的并发症［1］。脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）是常见的促脓毒症诱导因子，其也是体外模拟脓毒症心肌细胞损伤的诱导因子。miRNA是在生命体内广泛存在的非编码RNA，其大小约为20 nt，序列高度保守，具有多种生物学作用，参与人类疾病的进展［2］。研究显示，脓毒症的发生也与miRNA 的异常表达有关，miRNA 异常表达与脓毒症心肌细胞炎症因子分泌等有关［3］。miR-9 在人体内的多个组织和细胞中表达，具有调控细胞生长、组织炎症等功效。有研究表明，miR-9 在脓毒症中表达上调，敲除miR-9 可以减少脓毒症小鼠血清中炎症因子水平，延长小鼠的生存时间［4］。miR-9 在心肌细胞中表达，下调其表达改善缺氧诱导的心肌细胞损伤［5］。NF-κB 信号通路广泛参与人体内炎症反应、细胞增殖等过程，其在脓毒症中过度激活，下调其激活水平可以减轻脓毒症心肌损伤［6］。本实验研究miR-9 在脓毒症大鼠心肌组织中的表达变化，探讨下调miR-9 对LPS 诱导的大鼠心肌细胞炎症损伤的影响和机制，为靶向基因治疗脓毒症大鼠心肌损伤和研究脓毒症分子发生机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

SPF 雄性成年大鼠购自维通利华实验动物中心，体重200～220 g。大鼠心肌细胞H9C2 购自武汉普诺赛生命科技有限公司；inhibitor control、miR-9 inhibitor 购自上海吉玛制药技术有限公司；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；TNF-α 检测试剂盒购自上海瑞番生物科技有限公司；p65、p-p65 抗体购自美国Abcam；IL-6 检测试剂盒购自艾美捷科技有限公司；LPS 购自美国Sigma；IL-1β检测试剂盒购自上海岚派生物科技有限公司。

1.2 脓毒症模型构建［7］

大鼠分成2组，每组9只，为Model和Normal组。

1.3 qRT-PCR 检测脓毒症心肌组织中miR-9 表达

用Trizol 提取心肌组织中的总RNA，反转录合成cDNA。以cDNA 为模板进行qRT-PCR 反应，miR-9 以U6 作为内参，采用2-△△Ct法计算miR-9 相对表达量。

1.4 心肌细胞转染和分组处理

用含有10 μg/mL 的LPS 细胞培养液培养细胞（LPS 组）；LPS+Anti-NC、LPS+Anti-miR-9 组心肌细胞在实验开始前12 h 分别转染inhibitor control、miR-9 inhibitor；Control 组细胞正常培养。分别将Anti-NC、Anti-miR-9 共转染至心肌细胞，加入含有10 μg/mL 的LPS 细胞培养液培养细胞，分别记作LPS+Anti-NC 组、LPS+Anti-miR-9 组。

1.5 CCK-8 检测细胞活力

将心肌细胞按照“1.4”分组方法接种到96 孔板内（2×103个/孔），每孔添加10 μL 的CCK-8 溶液，继续放在37℃孵育2 h，以酶标仪测定450 nm的OD值。

1.6 ELISA 法检测细胞培养液上清中TNF-α、IL-6、IL-1β 水平

Control、LPS、LPS+Anti-NC、LPS+Anti-miR-9组细胞培养24 h 以后，收集培养液上清，分别用TNF-α 检测试剂盒、IL-6 检测试剂盒、IL-1β 检测试剂盒检测TNF-α、IL-6、IL-1β 水平，步骤完全按照试剂盒操作说明进行。

1.7 Western blot检测细胞中p65、p-p65蛋白表达水平

Control、LPS、LPS+Anti-NC、LPS+Anti-miR-9组细胞培养24 h，收集细胞，提取细胞总蛋白，BCA 法检测浓度，加入Loading Buffer 混合，沸水煮5 min。SDS-PAGE 凝胶电泳，转膜，室温封闭2 h，分别加入一抗稀释液与二抗稀释液，滴加ECL 显色，应用Image J 分析蛋白条带的灰度值，以β-actin作为参照，分析蛋白相对表达变化。p65、p-p65 一抗分别以1∶1 000和1∶800稀释，二抗以1∶2 000稀释。

1.8 NF-κB 信号激活剂对下调miR-9 影响心肌细胞分泌炎症因子的作用检测

心肌细胞转染miR-9 inhibitor 以后，用含有10 μg/mL 的LPS 和1 μmol/L 的NF-κB 信号激活剂PMA 细胞培养液培养，记为LPS+Anti-miR-9+PMA 组，以LPS+Anti-miR-9 组作为对照，CCK-8检测细胞活力，ELISA 法检测细胞培养液上清中TNF-α、IL-6、IL-1β 水平，Western blot 检测细胞中p65、p-p65 蛋白表达水平，步骤同上。

1.9 统计学分析

用SPSS 21.0 软件进行数据分析分析，计量资料用（）表示，两组数据用独立样本t检验，多组差异比较用单因素方差，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 miR-9 在脓毒症大鼠心肌组织中高表达

脓毒症大鼠心肌组织中miR-9 表达水平明显高于正常大鼠，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 脓毒症大鼠心肌组织中miR-9 表达水平（±s）Table 1 Expression level of Mir-9 in myocardium of septic rats（±s）

表1 脓毒症大鼠心肌组织中miR-9 表达水平（±s）Table 1 Expression level of Mir-9 in myocardium of septic rats（±s）

组别Normal Model t 值P 值miR-9 水平1.00±0.08 2.15±0.16 18.18＜0.001

2.2 miR-9 inhibitor 下调LPS 条件下心肌细胞中miR-9 表达水平

LPS 处理以后的心肌细胞中的miR-9 表达水平升高；转染miR-9 inhibitor 后的心肌细胞经过LPS 处理以后，细胞中的miR-9 表达水平下降，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 miR-9 inhibitor 转染前后LPS 条件下心肌细胞中miR-9 表达水平（±s）Table 2 Expression levels of Mir-9 in myocardial cells before and after transfection with Mir-9 inhibitor（±s）

表2 miR-9 inhibitor 转染前后LPS 条件下心肌细胞中miR-9 表达水平（±s）Table 2 Expression levels of Mir-9 in myocardial cells before and after transfection with Mir-9 inhibitor（±s）

注：与Control 比较，aP＜0.05；与LPS+Anti-NC 比较，bP＜0.05。

组别Control LPS LPS+Anti-NC LPS+Anti-miR-9 F 值P 值miR-9 水平1.00±0.10 1.96±0.13a 1.99±0.15 0.98±0.12b 160.30＜0.001

2.3 下调miR-9 减少LPS 诱导的心肌细胞分泌炎症因子

LPS 处理以后的心肌细胞活力降低，细胞分泌的TNF-α、IL-6、IL-1β 增多；转染miR-9 inhibitor后的心肌细胞经过LPS 处理以后，细胞分泌的TNF-α、IL-6、IL-1β 减少，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

2.4 下调miR-9抑制LPS诱导的心肌细胞中NF-κB信号通路激活

LPS 处理以后的心肌细胞中p-p65 蛋白表达水平增多；转染miR-9 inhibitor 后的心肌细胞经过LPS 处理以后，细胞中p-p65 蛋白表达水平减少，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图1、表4。

2.5 NF-κB 信号激活剂逆转下调miR-9 抑制LPS条件下心肌细胞分泌炎症因子作用

NF-κB 信号激活剂PMA 处理下调miR-9 的心肌细胞，经LPS 诱导以后，细胞中的p-p65 蛋白表达水平升高，细胞分泌的TNF-α、IL-6、IL-1β 水平升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图2、表5。

表3 miR-9 inhibitor 转染前后LPS 条件下心肌细胞分泌的TNF-α、IL-6、IL-1β 水平和细胞活力（±s）Table 3 Levels of TNF-，IL-6，IL-1 secreted by cardiomyocytes and cell activity before and after transfection with Mir-9 inhibitor（±s）

表3 miR-9 inhibitor 转染前后LPS 条件下心肌细胞分泌的TNF-α、IL-6、IL-1β 水平和细胞活力（±s）Table 3 Levels of TNF-，IL-6，IL-1 secreted by cardiomyocytes and cell activity before and after transfection with Mir-9 inhibitor（±s）

注：与Control 比较，aP＜0.05；与LPS+Anti-NC 比较，bP＜0.05。

组别Control LPS LPS+Anti-NC LPS+Anti-miR-9 F 值P 值TNF-α（pg/mL）223.54±12.05 1456.27±125.26a 1420.31±104.42 869.97±65.14b 403.40＜0.001 IL-6（pg/mL）165.24±13.28 1205.10±110.36a 1156.72±103.32 647.98±43.75b 349.10＜0.001 IL-1β（pg/mL）104.41±10.22 954.28±72.30a 968.51±63.25 559.76±60.43b 462.61＜0.001 OD 值（细胞活力）0.45±0.04 0.32±0.03a 0.31±0.04 0.42±0.05b 106.69＜0.001

表4 miR-9 inhibitor 转染前后LPS 条件下心肌细胞中p-p65、p65 表达水平（±s）Table 4 Expression levels of P-P65 and P65 in myocardial cells before and after transfection with Mir-9 inhibitor（±s）

表4 miR-9 inhibitor 转染前后LPS 条件下心肌细胞中p-p65、p65 表达水平（±s）Table 4 Expression levels of P-P65 and P65 in myocardial cells before and after transfection with Mir-9 inhibitor（±s）

注：与Control 比较，aP＜0.05；与LPS+Anti-NC 比较，bP＜0.05。

组别Control LPS LPS+Anti-NC LPS+Anti-miR-9 F 值P 值p65 0.89±0.09 0.87±0.07 0.88±0.10 0.86±0.11 0.15 0.96 p-p65 0.23±0.03 0.76±0.07a 0.74±0.05 0.31±0.04b 233.39＜0.001

3 讨论

miRNA 在自然界中广泛存在，是一类没有编码功能的小分子RNA，miRNA具有多种功能，在各种细胞生长、代谢、炎症等过程中发挥作用。研究报道显示，多种疾病的发生与miRNA的表达有关，miRNA可能是疾病治疗和诊断的分子标记物［8］。脓毒症的发生也受到miRNA 的调控作用，其表达改变与脓毒症损伤有关［9］。miR-9是目前发现的人体内普遍表达的调节因子，在肿瘤等多种疾病中发挥作用［10］。最近的研究表明，miR-9与脓毒症有关，其在脓毒症中表达上调，敲除miR-9 改善脓毒症小鼠炎症，下调miR-9 还可以抑制巨噬细胞炎症因子分泌［4］。miR-9是一种心肌损伤促进因子，其在缺氧、缺血心肌细胞损伤中发挥促进作用［5］。本次的实验表明，miR-9 在脓毒症大鼠心肌组织中表达上调，说明miR-9可能与脓毒症大鼠心肌损伤有关，这与上述研究报道结果相符合。

脓毒症是一种全身性的炎症反应，脓毒症心肌损伤是常见的脓毒症连续过程。研究显示，脓毒症发生时，心肌细胞释放大量的炎症因子，促进炎症损伤。LPS是脓毒症的促进因子，其可以在体外诱导心肌细胞损伤，促进心肌细胞释放炎症因子［11］。TNF-α、IL-6、IL-1β是常见的脓毒症炎症因子，其可以促进炎症发生，诱导心肌损伤［12］。本次的实验结果表明，LPS 处理以后的大鼠心肌细胞分泌的TNF-α、IL-6、IL-1β 增多，细胞活力下降，而下调miR-9 可以逆转LPS 对大鼠心肌细胞TNF-α、IL-6、IL-1β 分泌和细胞活力的影响，这说明下调miR-9具有抑制LPS诱导的心肌细胞损伤和炎症因子分泌的作用。

本实验还表明，LPS 处理以后的心肌细胞中p-p65 蛋白水平升高，p65 蛋白表达没有变化，而下调miR-9 可以降低心肌细胞中p-p65 蛋白表达水平，miR-9 作用机制可能与p-p65 有关。p-p65 是p65 的磷酸化形式，p65 是NF-κB 信号转导通路的关键亚单位［13］。NF-κB 是一个多功能调控因子，其激活后可以诱导组织炎症发生［14］。研究报道显示，脓毒症中NF-κB 过度激活，而抑制NF-κB 信号可以改善脓毒症心肌损伤［15］。

表5 NF-κB 信号激活剂处理miR-9 inhibitor 转染后LPS 条件下心肌细胞中p-p65、p65 表达水平、细胞活力和分泌的TNF-α、IL-6、IL-1β 水平（±s）Table 5 Expression levels of P-P65 and P65，cell activity，and secretion of TNF-，IL-6 and IL-1 in myocardial cells treated with NF-B signal activator after Mir-9 inhibitor transfection（±s）

表5 NF-κB 信号激活剂处理miR-9 inhibitor 转染后LPS 条件下心肌细胞中p-p65、p65 表达水平、细胞活力和分泌的TNF-α、IL-6、IL-1β 水平（±s）Table 5 Expression levels of P-P65 and P65，cell activity，and secretion of TNF-，IL-6 and IL-1 in myocardial cells treated with NF-B signal activator after Mir-9 inhibitor transfection（±s）

注：与LPS+Anti-miR-9 比较，aP＜0.05。

组别LPS+Anti-miR-9 LPS+Anti-miR-9+PMA t 值P 值p65 0.87±0.12 0.85±0.10 0.36 0.72 p-p65 0.34±0.05 0.79±0.09a 12.36＜0.001 TNF-α（pg/mL）875.36±52.17 1395.47±109.94a 12.09＜0.001 IL-6（pg/mL）684.20±55.32 1105.58±92.36a 11.07＜0.001 IL-1β（pg/mL）570.86±43.31 1034.01±85.52a 13.67＜0.001 OD 值（细胞活力）0.44±0.06 0.36±0.02a 3.58 0.003

综上，miR-9 在脓毒症大鼠心肌组织中高表达，下调miR-9 可以抑制LPS 诱导的心肌细胞分泌炎症因子，其作用机制与下调NF-κB 信号激活水平有关。miR-9 在脓毒症心肌损伤中可能发挥促进作用，靶向抑制miR-9 可能是减轻脓毒症心肌损伤的途径。本次实验结果为研究脓毒症心肌损伤发生机制提供了参考。在以后实验中会探讨miR-9 通过何种靶向机制影响调控NF-κB 信号激活进而影响炎症发生。