miR-217在hADSCs增殖与成骨分化中的作用及其机制研究

韦宗勇，肖展宏，黎裕明

南宁市第一人民医院康复医学科1、骨科2，广西 南宁 530001

骨骼为支撑人体运动的主要结构，在日常生活中易因创伤而骨折，骨缺损、骨折愈合不良是临床一大难题。组织工程成骨分化为临床骨组织需求带来了希望之光，种子细胞如人脂肪组织源性间充质干细胞(hADSCs)是组织工程成骨分化的核心和重点[1]。hADSCs 身体储量丰富、来源广泛、容易获得、低免疫原性、培养便捷、性能稳定、分化潜能好[2]。然而目前hADSCs 定向成骨分化能力仍未达到临床标准，因而制约了其临床应用。诸多研究显示miRNAs参与了人体多种生理、病理过程，包括调控干细胞向成骨细胞分化[3]。miR-217 在多种细胞系中发挥了不同的生理功能，本课题主要检测miR-217 在调控hADSCs 成骨分化中发挥的作用机制，以期能为优化hADSCs 定向成骨分化的组织工程化骨提供相关数据。

1 材料与方法

1.1 材料 DMEM 培养基、胎牛血清、双抗购自Gibco；Dexamethasone、β-glycerophosphate、Vitamin-C购自Sigma公司；Trizol试剂盒(Invitrogen)、PCR试剂盒(Applied Biosystems)，Lipo 3000 (Invitrogen)，miR-217 mimic、miR-217 inhibitor和对照购自上海吉凯。

1.2 方法

1.2.1 hADSCs分离培养 依据既往研究报道[4]，经过伦理委员会批准，和经得本人签署知情同意书，获取人体脂肪组织并分离hADSCs，培养于10%胎牛血清(FBS)的DMEM 培养基中，取第三代细胞用于后续研究。

1.2.2 hADSCs 成骨诱导 将不同分组的hADSCs 接种于6 孔板、每组3 个复孔，待细部贴壁后进行诱导成骨分化，进行诱导成骨分化，诱导培养基的组成成分包括10%FBS、0.1 μmol/L Dexamethasone、10 mmol/L β-glycerophosphate和50 mg/L Vitamin-C。

1.2.3 细胞转染 依据说明书进行操作，将miR-217 模拟物和miR-control、miR-217 抑制剂和对照物转染至hADSCs，24 h 后更换培养基。hADSCs细胞生长融合度达到约70%时采用成骨诱导培养基、进行诱导分化。

1.2.4 qPCR 反应 提取总RNA，逆转录cDNA，进行qRT-PCR。其反应条件：95℃预变性5 min，95℃变性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，40 个循环。随后以GAPDH 为内参、采用2-ΔΔCt法计算各个基因相对表达量。miRNA 扩增以BioTNT 的miRNA 定量PCR试剂盒操作，U6 作为内参。引物序列见表1。

表1 引物序列

1.2.5 茜素红染色 成骨分化诱导14 d，磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗2 次，95%乙醇固定10 min，双蒸水洗3 次，配制pH 8.3 的0.1%ARS-Tris-Hcl 染料，37℃反应1 h，光学显微镜下观察染色情况。

1.3 统计学方法 采用SPSS17.0 统计软件分析数据，所有计量资料符合正态分布，以均数±标准差(x-±s)表示，两两比较采用t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 hADSCs生长曲线 倒置相差显微镜下显示第三代hADSCs 呈梭形、束状或者纺锤形的细胞状排列，细胞核位于中央、细胞轮廓清晰、体外附着于细胞培养瓶上的一定底物而生长(图1)。CCK8 检测显示hADSCs 细胞生长曲线呈现S 形，3～6 d 为细胞对数生长期，6 d达高峰后随后逐渐降低进入平台期。

2.2 miR-217在hADSCs 成骨分化中高表达 为了检测hADSCs成骨分化过程中参与的microRNA，分别于0 d及21 d收集诱导分化的细胞、提取总RNA，基因芯片显示此过程中多个microRNA 表达上调，其中miR-412-5p、miR-19a-3p 、miR-217 升高趋势最明显。随后提取0 d、7 d、14 d及21 d诱导分化细胞的总RNA，采用qRT-PCR 检测显示随着hADSCs 成骨诱导时间延长，miR-412-5p、miR-19a-3p 、miR-217 表达都逐渐升高、每个时间点与诱导前比较差异均有统计学意义(P＜0.05)，其中miR-217升高最显著，因此本研究选择miR-217作为后续研究，见图2。

图1 第3代hADSCs形态及生长曲线

2.3 miR-217调控hADSCs增殖 应用12.5 nmol/L、25 nmol/L 及50 nmol/L 浓度的上述质粒[miR-217 模拟物(miR-217 mimics)和miR-control、miR-217 抑制剂(miR-217 inhibitors)和anti-miR-control]转染hADSCs，qRT-PCR 结果显示miR-217 mimics 和inhibitors分别显著促进或抑制miR-217表达，效果体现出浓度剂量依赖性，组间比较差异有统计学意义(P＜0.05)，见图3。后续试验采用50 nmol/L 浓度的miR-217 模拟物或抑制剂。

图2 microRNA在hADSCs成骨分化过程中表达情况

为了验证miR-217 对hADSCs 增殖的调控，hADSCs 分 为 四 组(miR-217 mimics 和miR-control、miR-217 inhibitors 和anti-miR-control)，处理0 d、1 d、2 d、3 d 和4 d后中断反应，CCK8 检测发现miR-217 mimics 促 进hADSCs 增 殖，miR-217 inhibitors 抑 制hADSCs增殖，差异有统计学意义(P＜0.05)，见图4。

2.4 miR-217 促进hADSCs 成骨分化 为探讨miR-217 调节hADSCs 成骨分化的效果，实验细胞按照上述分组，诱导7 d 后提取总RNA。RT-PCR 结果显示，miR-217 mimics 能促进hADSCs 内成骨相关基因ALP (碱性磷酸酶)、OCN (骨钙蛋白)、Runx2(Runt 相关转录因子2)、Osterix (成骨细胞特异转录因子)mRNA 的表达，miR-217 inhibitors 则抑制上述基因表达，组间比较差异具有统计学意义(P＜0.05)，见图5。

图3 RT-PCR检测各浓度转染组miR-217的相对表达量

图4 CCK8 检测发现miR-217 mimics 促进hADSCs 增殖，miR-217 inhibitors能够抑制hADSCs增殖

茜素红染色显示miR-217 mimics 处理并成骨诱导7 d 后的hADSCs细胞茜素红染色阳性明显增强，转染miR-217 inhibitors 后细胞茜素红染色阳性显著减弱，提示过表达miR-217 可增强hADSCs 的成骨钙沉积活性，见图6。

图5 miR-217 mimics和miR-217 inhibitors对成骨相关基因表达的调控注：RT-PCR显示miR-217 mimics能促进ALP(A)、OCN(B)、Runx2(C)、Osterix(D)mRNA表达，miR-217 inhibitors抑制上述基因表达；aP＜0.05。

图6 miR-217 调控hADSCs成骨分化的茜素红染色结果(×20)

3 讨论

骨骼为支撑人体运动的主要结构，日常生活中易因创伤而骨折，骨缺损、骨折愈合不良是临床一大难题。组织工程成骨为临床骨组织需求带来希望，种子细胞是组织工程的重点，hADSCs身体储量丰富、来源广泛、获取容易、免疫原性低、培养便捷、性能稳定、分化潜能好，因而是首选种子细胞。然而目前hADSCs定向成骨分化能力仍未达到临床标准，因而制约了其临床应用，外源性干预有助于提高hADSCs 成骨分化效率，因而值得进一步研究。

microRNA(miRNA，微小RNA)是近年来逐渐引起广泛关注和重视的、在真核生物中发现的一类5'端带磷酸基团、3'端带22 nt左右长度羟基的内源性非编码调控RNA。成熟的miRNAs 是由较长的初级转录物经过一系列核酸酶剪切加工而产生，随后组装进RNA成为诱导沉默复合体，通过碱基互补配对的方式识别靶mRNA，并根据互补程度的不同指导沉默复合体降解靶mRNA 或者阻遏靶mRNA 的翻译。miRNA的主要功能为调节内源基因表达，参与细胞周期调控及个体发育进程。研究显示miRNAs参与了多种细胞生物行为学功能、发挥了极其重要的作用，如miRNAs调控间充质干细胞的增殖、凋亡和向成骨细胞分化[5]。既往研究显示miR-384-5p通过调控下游靶基因Gli2、从而达到抑制BMSCs 细胞的成骨分化[6]；SIRT1 通过miR-132-3p 调控MC3T3-E1 细胞成骨分化，SIRT1 过表达能够促进细胞MC3T3-E1 增殖和成骨分化[7]；miR-124 可以通过靶基因Sp7 来调节BMSCs 细胞的成骨分化，miR 124 mimics 能够显著上调BMSCs 细胞内成骨相关基因ALP和osteocalcin表达[8]；CHEN等[9]通过活体和离体实验发现过表达miR-375 促进hADSCs成骨分化，并且证实miR-375是通过靶基因YAP1和YAP1/DEPTOR/AKT 网络来调控hADSCs 成骨分化。miR-217的相关研究已经有诸多报道，miR-217通过靶基因SIRT1抑制骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭[10]；miR-217 通过抑制靶基因TLR5 表达从而缓解神经病理学疼痛[11]；miR-217 通过抑制靶基因DKK1 促进BMSCs 细胞增殖和成骨分化[12]。miRNA 对hADSCs成骨分化的研究也有相关报道，然而现在尚无关键性进展，亦无临床应用。

本研究通过分离并离体培养hADSCs、诱导其成骨分化，采用CCK8 及qRT-PCR 等方法检测miR-217对hADSCs 成骨分化的调控作用。结果发现随着hADSCs 成骨分化进程的进展，miR-217 表达呈上升趋势，推测miR-217 可以正向调控hADSCs 成骨分化。随后采用miR-217 mimics 和miR-217 inhibitors分别过表达和抑制hADSCs 细胞中miR-217 的表达，同时检测hADSCs 成骨分化的进程。结果发现miR-217 模拟物能促进hADSCs 内成骨相关基因Osterix、OCN、Runx2、ALP mRNA 的表达，miR-217 抑制剂则可以抑制上述成骨相关基因表。同时为直观观察hADSCs 成骨分化的矿化结节，我们采用茜素红染色检测hADSCs 是否已经成功向成骨细胞分化，结果显示miR-217 mimics 转染显著增强了hADSCs 细胞茜素红染色阳性；提示miR-217 对hADSCs 成骨分化起着正向调控作用。

综上所述，本研究系统性地研究miR-217对hADSCs 细胞增殖和成骨细胞分化的影响作用，我们发现miR-217 可以正向促进hADSCs 内成骨相关基因Osterix、OCN、Runx2、ALP 的表达，提示过表达miR-217可以正向促进hADSCs成骨分化的进程。