结肠癌中miR-592、SOX9的表达与临床病理特征及预后的关系

陈玉昌，吴秋菊

1.长武县人民医院内科，陕西 咸阳 713600；2.渭南市第二医院消化内科，陕西 渭南 714000

结肠癌是一种常见的消化道恶性肿瘤，在男性和中老年人群中发病率较高，病死率极高。近年来，由于人们饮食结构改变、吸烟酗酒等不良习惯增加，结肠癌发病处于上升趋势。若结肠癌不能得到有效诊断和治疗，将严重威胁人类生命健康[1]。研究发现，微小RNA(MicroRNA，miRNA)-592 在肝癌细胞中下调，与肝癌患者淋巴结转移、肿瘤侵袭及生存率降低等相关[2]。神经胶质瘤组织中miR-592也被证实低表达，上调其表达能显著抑制该肿瘤细胞生长，促进细胞凋亡[3]。Sry相关组蛋白9 (Sry related HMG box 9，SOX9)是一种与细胞增殖、分化密切相关的核转录因子。近年研究发现，SOX9 蛋白高表达与肝癌患者不良预后有关[4]。SOX9表达上调可通过调控表皮生长因子受体家族基因ERBB 表达促进胰腺癌进展[5]。然而miR-592 和SOX9 与结肠癌的关系未见研究。本研究通过检测miR-592、SOX9 在结肠癌组织中表达情况，分析其与患者临床病理特征及预后关系，探讨其在结肠癌进展中意义及对预后评估价值。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选择2010 年2 月至2016 年2 月在长武县人民医院治疗的106例结肠癌患者为研究对象。纳入标准：①临床病理检查确诊为结肠癌；②术前未进行放、化疗者；③临床及随访资料完整。排除标准：①合并患有其他部位肿瘤者；②心、肾、肝脏等功能严重不足者；③患有严重精神疾病者。106 例患者中男性62例，女性44例；年龄31～73岁，平均(58.35±18.39)岁；根据美国癌症联合会TNM分期(第八版)[6]中的标准：Ⅰ期23例，Ⅱ期36例，Ⅲ期47例；按肿瘤部位分类：左半结肠52 例，右半结肠54 例；按分化程度分类：高分化32例、中分化44例、低分化30例；按浸润程度分类：T1～T250 例，T3～T456 例。本研究经本院伦理委员会批准。

1.2 主要仪器和试剂 荧光定量PCR 仪(型号：Mx3005P，美国Stratagene 公司)，光学显微镜(型号：DM500，德国徕卡公司)。反转录试剂盒(货号：RR047a，日本TaKaRa公司)，实时荧光定量(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)试剂盒(货号：DRR041A，日本TaKaRa公司)，免疫组织化学染色试剂盒(货号：8841-6599-45，美国Invitrogen 公司)，兔抗人SOX9 多克隆抗体(货号：PA5-86301，美国Invitrogen公司)。

1.3 实验方法

1.3.1 样本采集 收集入组结肠癌患者经手术切除的癌组织及癌旁正常组织(距肿瘤部位＞5 cm)。一部分放入液氮中迅速冷却之后，研磨并用Trizol 法提取RNA，经反转录后将所得cDNA 于-80℃冰箱保存，用于qRT-PCR实验。另一部分用10%福尔马林溶液中固定后，制成4 μm厚石蜡切片用于免疫组织化学染色实验。

1.3.2 qRT-PCR检测miR-592及SOX9 mRNA表达水平 使用qRT-PCR试剂盒配制实验所用反应体系，20 μL 反应体系如下：50×ROX Reference Dye 0.4 μL，2×SYBR®Premix Ex TaqTM10 μL，上游引物0.4 μL，下游引物0.4 μ L，cDNA 2 μ L，DEPC 处理水6.8 μ L。qRT-PCR 反应程序如下：第一步95℃，30 s。第二步95℃，10 s；61℃，33 s；40℃，1 min，第二步40 个循环。一个样品三个重复，使用2-△△CT法计算目的基因相对表达量。本次qRT-PCR所用引物如表1所示，miR-592以U6为内参基因，SOX9以GAPDH为内参基因。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.3 免疫组织化学染色 (1)染色方法：SOX9抗体稀释比为1：100，按照免疫组化染色试剂盒说明书进行实验。切片经二甲苯、酒精脱蜡、脱水后后用H2O2溶液浸泡15 min。在柠檬酸盐缓冲液中加热10 min。磷酸盐缓冲液(PBS)冲洗切片3次。甩干后滴加0.25%牛血清蛋白，室温孵育40 min。加SOX9 抗体，4℃孵育14 h。复温90 min、PBS 清洗后加生物素标记的二抗39℃下孵育25 min，取出后用PBS 清洗3 次，每次5 min。用DAB 显色剂显色，10 min 后苏木素复染1 min，冲洗、脱水后二甲苯固定，风干后封片。显微镜下观察，并采集图像资料，400倍镜下选择5个视野记录阳性细胞数。(2)染色结果判定：细胞核中出现棕黄色或棕褐色颗粒为阳性细胞。分别根据染色强度和阳性细胞比例记分。①染色强度：无色记0分，淡黄色记1分，棕黄色记2 分，棕褐色记3 分。②阳性细胞比例：＜5%记0分，5%～25%记1 分，26%～50%记2 分，51%～75%记3分，＞75%记4分。两种记分相乘，0 分为阴性(-)，1～4分为弱阳性(+)，5～8 分为阳性(++)，9～12 分为强阳性(+++)，其中阴性(-)、弱阳性(+)定义为高表达，阳性(++)、强阳性(+++)为低表达。

1.4 随访 入组患者经治疗出院后，以电话或复查方式对其进行3 年随访，每3 个月1 次，随访期间观察并记录患者生存情况。

1.5 统计学方法 应用SPSS22.0 软件对本研究中数据进行分析。计量资料以均数±标准差(±s)表示，组间两两比较采用t 检验；计数资料比较采用χ2检验；采用Pearson 法进行相关性分析；Kaplan-Meier 法绘制生存曲线，行log-rank检验；用Cox比例风险回归模型进行危险因素分析。以P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结肠癌组织和癌旁组织的miR-592、SOX9 mRNA 表达水平比较 结肠癌组织中的miR-592 表达水平显著低于癌旁组织，SOX9 mRNA 水平显著高于癌旁组织，差异均有统计学意义(P＜0.05)，见表2。

2.2 结肠癌组织和癌旁组织的SOX9 蛋白表达水平比较 SOX9 蛋白主要在细胞核中表达，结肠癌组织中SOX9 蛋白阳性表达率明显高于癌旁组织，差异有统计学意义(χ2=51.080，P＜0.05)，见表3和图1。

images/BZ_20_1272_781_2269_814.png组别结肠癌组织癌旁组织例数106 106-38 89+30 12images/BZ_20_1875_845_1913_988.png+++12 0阳性率(%)64.15 16.03

表2 结肠癌组织和癌旁组织的miR-592、SOX9 mRNA 表达水平比较(±s)

表2 结肠癌组织和癌旁组织的miR-592、SOX9 mRNA 表达水平比较(±s)

组别结肠癌组织癌旁组织t值P值例数106 106 miR-592/U6 0.56±0.16 0.99±0.30 13.021＜0.05 SOX9/GAPDH 2.38±0.74 1.01±0.32 17.495＜0.05

图1 结肠癌组织中SOX9蛋白表达(免疫组织化学染色，×400)

2.3 结肠癌组织中miR-592、SOX9 表达水平与临床病理特征的关系 将入组患者以结肠癌组织中miR-592 表达水平平均数(0.59)和SOX9 蛋白免疫组织化学染色结果，分为高表达组和低表达组。结肠癌组织中miR-592、SOX9 表达水平与性别、年龄、肿瘤直径、肿瘤部位无关(P＞0.05)，与分化程度、浸润程度、TNM 分期、淋巴结转移、远处转移有关(P＜0.05)，见表4。

表4 miR-592、SOX9表达与结肠癌患者临床病理特征的关系[例(%)]

2.4 结肠癌组织中miR-592、SOX9 mRNA表达相关性 如图2 所示，结肠癌组织中miR-592 与SOX9 mRNA表达水平呈负相关(r=-0.562，P＜0.05)。

图2 结肠癌组织中miR-592与SOX9相关性分析

2.5 miR-592和SOX9表达与结肠癌患者预后相关性 通过Kaplan-Meier 生存分析可知，miR-592 低表达组患者3 年生存13 例，死亡46 例；miR-592 高表达组患者3年生存32例，死亡15例。miR-592低表达组患者3年总生存率为22.03%，明显低于高表达组患者的68.08%，差异有统计学意义(P＜0.05)。

SOX9 高表达组患者3 年生存16 例，死亡52 例；SOX9 低表达组患者3 年生存29 例，死亡9 例。SOX9 高表达组患者3 年总生存率为42.11%，明显低于低表达组患者的76.32%，差异有统计学意义(P＜0.05)，见图3。

图3 Kaplan-Meier生存分析

2.6 结肠癌患者预后影响因素 Cox 回归模型单因素分析结果显示，性别、年龄、肿瘤直径、肿瘤部位与结肠癌患者预后无关(P＞0.05)；右半结肠、低分化、T3-T4浸润、TNM分期Ⅲ期、淋巴结转移、miR-592低表达、SOX9 高表达是影响结肠癌患者不良预后的危险因素(P＜0.05)。多因素分析结果显示，TNM 分期Ⅲ期、淋巴结转移、miR-592 低表达、SOX9 高表达是影响结肠癌患者不良预后的独立危险因素(P＜0.05)，见表5。

表5 结肠癌患者预后的影响因素

3 讨论

结肠癌患者在患病初期不易被确诊，多数患者入院治疗时肿瘤已进展至中晚期[7]，临床探究与结肠癌相关的早期诊断标志物及结肠癌预后影响因子，对提高结肠癌诊断效果、改善患者预后有一定意义。miRNA是一类具有调控功能的短链RNA，在肿瘤进展中有调控作用。研究表明，miR-126在结肠癌组织中低表达，可作为结肠癌潜在诊断标志物和治疗靶点[8]，miR-375在结肠癌中也被证实显著下调，可靶向抑制结肠癌细胞增殖、迁移，促进细胞凋亡[9]，表明多种miRNA与结肠癌进展有关，可能影响结肠癌患者预后。

miR-592属于miRNA家族，据报道miR-592在乳腺癌组织中明显下调，体外过表达miR-592可显著抑制乳腺癌细胞增殖、迁移和侵袭[10]。LI等[11]发现，非小细胞肺癌组织中miR-592表达下调，可能作为生物标志物诊断预测非小细胞肺癌发生发展[11]。本研究结果表明，结肠癌组织中miR-592 表达水平显著降低，差异有统计学意义，与前人在乳腺癌[10]和非小细胞肺癌[11]中研究结果一致，提示miR-592 可能与结肠癌发生有关[10，12]。JIA 等[12]研究报道，miR-592 在肝癌细胞中低表达，与肿瘤分期和淋巴结转移等有关。本研究发现，miR-592表达水平变化与结肠癌分化程度、浸润程度、TNM 分期、淋巴结转移、远处转移有关，提示miR-592 低表达可能通过影响结肠癌细胞增殖、侵袭等促进肿瘤分化程度降低、TNM 分期升高、淋巴结转移及远处转移，参与结肠癌进展。

SOX9作为SOX家族转录因子一员，具有SOX家族共性，与人类生长发育多种生物过程有关。研究发现，敲除SOX9 可显著抑制甲状腺乳头状癌细胞增殖和侵袭[13]。SOX9 被发现在非小细胞肺癌组织中表达上调，与肿瘤转移有关[14]。另有研究报道，SOX9高表达与胃癌淋巴结转移和患者低生存率有关[15]。本研究中，SOX9 mRNA在结肠癌组织中表达水平显著上调，且SOX9蛋白在结肠癌组织中阳性表达率显著高于癌旁组织，差异均有统计学意义。进一步分析发现，SOX9 蛋白表达水平与分化程度、浸润程度、TNM 分期、淋巴结转移有关，与前人在甲状腺肿瘤[13]和胃癌[15]中研究结果一致，提示SOX9 表达上调可能通过调控癌细胞增殖和迁移，影响肿瘤低分化、TNM分期升高、淋巴结转移及远处转移，促进结肠癌发生发展。

另本研究结果显示，miR-592 低表达、SOX9 高表达组患者3 年总生存率分别显著低于miR-592 高表达、SOX9低表达组患者，提示miR-592低表达、SOX9高表达可能预示结肠癌患者生存率低等不良预后。且低分化、T3-T4浸润、TNM 分期Ⅲ期、淋巴结转移、miR-592 低表达、SOX9 高表达是影响结肠癌患者不良预后危险因素，进一步提示miR-592、SOX9 可作为评估结肠癌患者不良预后的生物标志物。LI 等[11]研究发现，miR-592 可能通过抑制SOX9 蛋白活性在非小细胞肺癌中作为抑癌因子发挥作用。本研究经Targetscan 网站预测发现，SOX9 是miR-592 的靶基因，且结肠癌组织中miR-592 与SOX9 mRNA 水平呈负相关，提示miR-592和SOX9可能相互作用，共同参与结肠癌发生发展，与LI等[11]在非小细胞肺癌研究中结果相似，但具体作用机制有待进一步研究。

综上所述，结肠癌组织中miR-592 表达下调、SOX9 表达上调，与肿瘤部位、分化程度、TNM 分期、淋巴结转移及患者生存率低等有关，两者之间可能存在作用机制共同参与结肠癌进展，对结肠癌预后评估有一定意义。但本研究未能深入研究miR-592 与SOX9 相互作用机制，将在下一步研究中进行验证和探究。