5种长链非编码RNA在结肠癌患者血清学诊断中的应用价值

刘茵茵 罗丹 屈晶晶 闫晓煜

结肠癌是目前全世界高发的恶性肿瘤［1］，严重威胁人们的身心健康。众所周知，早期结直肠癌患者治愈率比较高，5年生存率可达到90%，但因缺乏有效的早期诊断方法，结肠癌患者确诊时多已为中晚期，其生存率仅为10%～15%［2］。最新研究表明，目前结肠镜检查仍然是对结肠癌敏感性最高的筛查工具，但有一定风险，且目前尚无更好的筛查方法可以替代［3］。病例分期是术后正确选择治疗方案、制定随访计划和预测生存率的关键依据［4］，而TNM分期仍然是最强大的预测指标［5］。lncRNAs是近年来发现的一类非编码RNA，其会产生长＞200bp且多的外显子转录本，这些转录本通常不会被翻译成蛋白质［6］。近年来大量研究表明，肿瘤的复发、转移及患者的预后均与lncRNAs的表达失调密切相关，其表达谱可能作为诊断恶性肿瘤的一类新的生物标志物［7-9］。结肠癌的演变进程复杂且缓慢，涉及繁杂的基因和蛋白表达变化。因此，筛查并验证结肠癌相关基因及蛋白的表达谱有利于提高早期结肠癌的诊断率，从而提高患者治愈率并延长生存时间。多项研究表明［10，11］，在结肠癌组织中多条lncRNAs表达上调，且与患者不良预后紧密关联，如CCAT1、HOTAIR。仍有大量结肠癌相关的lncRNAs亟待探索。随着对lncRNAs与结肠癌的深入研究，其异常表达对结肠癌发生发展、侵袭转移的作用也将越来越明确，很有可能寻找到对结肠癌高度敏感的lncRNAs作为结肠癌早期诊断的重要指标。故而，本研究将针对5种筛选出的lncRNAs构建多个指标联合筛检早期结肠癌的Logistic多因素分析模型，探索其在结肠癌患者血清学诊断中的应用价值。

1 材料与方法

1.1 主要仪器 STEP one plus QPCR(美国ABI公司)，高速冷冻离心机(湖南凯达科学仪器有限公司)，水平电泳槽(北京六一)，电泳仪电源(北京六一)。

1.2 主要试剂 Trizol Reagent A350-1(invitrogen)，逆转录RT试剂盒(Fermentas)，Power SYBR Green PCR Master Mix(ABI)，RNA酶抑制剂(Fermentas)，96孔PCR板密封盖(Axygen)，AgaroseⅠ琼脂糖(Amresco)等试剂。

1.3 方法

1.3.1 43例结肠癌患者(结肠癌组)中各型结肠癌临床诊断均符合《中国结直肠癌诊疗规范(2017)》［2］，男27例，女16例；年龄40～70岁。27例正常对照组(NC组)中男12例，女15例；年龄27～71岁，均为同期体检正常并排除其他干扰疾病的健康者。

1.3.2 筛选目标lncRNAs采用文献筛选的方法筛选结肠癌患者中表达差异的lncRNAs(5条)作为研究对象。

1.3.3 qRT-PCR验证表达差异的lncRNAs采用TRIzol LS法提取血清样本中的总RNAs。采用qRTPCR相对定量法检测候选的5种lncRNAs的表达情况。

1.3.4 将结肠癌组与NC组组成一个有序分类变量，分析lncRNAs表达谱诊断结肠癌的正确率。

1.4 统计学方法 采用SPSS21.0统计学软件对实验数据进行ROC和Logistic回归分析。t检验作两组间的比较；ROC曲线法计算每个lncRNAs诊断结肠癌的Se、Sp、Youden指数、AUC、cut off等特征参数。

2 结果

2.1 两组血清中lncRNAs的表达情况比较 两组血清中lncRNAs的ROC曲线，见图1。结肠癌组CCATI、HOTAIR、LincRNAP2、SOX2OT、ANRIL的表达值分别为(25.62±17.07)、(4.71±2.86)、(1.29±0.63)、(2.98±1.41)、(3.81±2.62) ；NC组 CCATI、HOTAIR、LincRNAP2、SOX2OT、ANRIL的表达值分别为(1.39±0.71)、(1.04±0.45)、0.81±0.41)、(1.26±0.63)、(1.36±0.80)；结肠癌组CCATI、HOTAIR、LincRNAP2、SOX2OT、ANRIL的表达值高于NC组，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

图1 结肠癌组血清中lncRNAs的ROC曲线

2.2 5种lncRNAs中ROC分析结果及特征参数 CCAT1的AUCROC最高，达到0.924；其次分别为HOTAIR(0.904)、SOX2OT(0.895)、ANRIL(0.868)，而LincRNAP2的AUCROC最低，仅0.602，故而此次试验排除该条lncRNAs，不将其作为联合预测分期的选择；灵敏度最高的是CCAT1，最低的是SOX2OT；特异度最高的是CCAT1，最低的是LincRNAP2。见表2。

表1 两组血清中lncRNAs的表达情况比较()

表1 两组血清中lncRNAs的表达情况比较()

注：与NC组比较，aP＜0.05

表2 5种lncRNAs中ROC分析结果及特征参数

2.3 系列试验组合检测特征参数 鉴于结肠癌患者血清CCAT1表达值的Se、Sp均较高，为大量研究和试验所证实，故此以CCAT1为基本检测项目，结合文献及试验筛选出的3种lncRNAs，进行CCAT 1加 1～ 3种的lncRNAs系列试验，筛选 Youden指数和准确度高组合项。见表3。

表3 系列试验组合检测特征参数

3 讨论

据报道，肿瘤的复发、转移以及患者的预后均与lncRNAs的表达失调紧密关联，其表达谱可能成为诊断恶性肿瘤的一类新的生物标志物。作为标志物，Se与Sp越高，准确性越高，用于早期诊断、疗效评估、预后判定等的价值越高［12］。目前结肠镜检查是对结肠癌敏感性最高的筛查工具，但过程有一定风险；而lncRNAs仅需抽取患者血清即可进行检测，无风险，但若应用于临床，还需有较高的Se或 Sp［13］。一种lncRNAs检测能力有限，若联合几种lncRNAs标志物可以提高诊断效率。本研究所检测的5种肿瘤标志物，其中CCAT1在结肠癌中的作用研究已相对成熟，但其尚未应用于临床，Se与Sp还需进一步提高。本文联合Logistic多因素分析方法和ROC曲线，用AUCROC、Se、Sp等指标探索lncRNAs的诊断价值。

3.1 单项指标鉴别诊断结肠癌的临床价值 本研究对ROC区线下面积和Se、Sp、Youden等指标进行了综合评价，最大限度提高评价诊断试验准确性。本研究结果显示，用于诊断结肠癌的lncRNAs中，AUCROC≥0.7的指标有CCAT1、HOTAIR、SOX2OT、ANRIL，表明其有一定的准确性，可作为预测结肠癌的单项指标。其中又以CCAT1的AUCROC最大，诊断价值最高，其Sp、Youden指数、Se也最大；而LincRNAP2的AUCROC最低，故而舍弃。

3.2 多指标联合诊断对诊断结肠癌的临床价值 理想的鉴别指标要求既灵敏又特异，高Se利于筛选，减少漏诊; 高Sp则有助于诊断，避免误诊。在临床实践中，经常会应用多指标的联合进行诊断。本文联合诊断常采用系列试验，可提高Sp。本研究结果显示，多指标联合诊断的效率明显优于单项指标，且随着联合指标的增加，系列试验的Sp随之升高，表明联合诊断的指标越多其诊断效率越高。但并非指标越多越好，鉴于CCAT1研究相对成熟其作用已被证实［14］，本研究以CCAT1为基本检测项目，联合其他标志物进行CCAT1加其他1～3项随机组合的联合试验，做等级多分类Logistic回归分析，然后用其概率做ROC曲线，结果显示，系列试验中CCAT1+HOTAIR+SOX2OT的平行线检验大于0.05，该假设被认可，而且其组合Sp为98.4%，Youden指数0.856，Se为87.2%，AUCROC为0.982。

本研究尝试应用Logistic回归综合多指标信息，根据 ROC曲线确定诊断界值，同时增加诊断的Se和Sp。本次研究中单个CCAT1用于诊断结肠癌，其AUCROC达到0.924，Se达到0.903，Sp达到0.894，说明其对结肠癌的鉴别效能较高。

综上所述，CCAT1将可能作为结肠癌的诊断、病情监测及患者预后评估的分子标记物，但其对结肠癌TNM分期的鉴别效能有待进一步研究。经文献筛选出的LincRNAP2，在本次研究中却不具有检验效能，可能与样本量过少有关，其具体效能有待商榷。多指标联合诊断的效率优于单项指标，且联合指标增加，系列试验的特异度随之升高。该方法亦可应用于其他疾病诊断实验的资料分析中，有着广泛的应用前景。