川参通注射液中总酚酸、总黄酮及单糖大类成分的含量测定*

何峰，余明丽，姚光哲，张昀**

(1.贵州医科大学 药学院，贵州 贵阳 550025；2.贵州瑞和制药有限公司，贵州 贵阳 550002)

川参通注射液由丹参、当归、麦冬及川芎提取精制而成，临床上用于良性前列腺增生症所致的小便不畅、排尿费力及淋漓不尽等症[1-2]。通过文献调研及前期试验发现，川参通处方中主要含有酚酸、黄酮、萜烯及糖类等成分[3]，其中酚酸是一类含有酚环的有机酸，包括单羟基苯甲酸和双羟基苯甲酸等[4-5]；黄酮类化合物是一类存在于自然界的、具有2-苯基色原酮结构的活性化合物[6-8]；单糖是不能再水解的糖类，是构成各种多糖的基本单位[9-11]。由于川参通注射液所含化学成分十分复杂，仅通过测定某个或某几个化学成分的含量已无法满足中药注射剂的质量控制要求，因此为尽可能地明确所含大类成分的种类及含量，本研究采用紫外分光光度法对川参通注射液中总酚酸、总黄酮和单糖大类成分进行分析和含量测定，确定大类成分在固形物中的比例，为川参通注射液质量控制提供实验依据。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1药品 川参通注射液成品(批号170909～171015)，4 mL/支，购自贵州瑞和制药有限公司；D-无水葡萄糖对照品(批号110833-201205)、原儿茶醛对照品(批号110810-201007)及芦丁对照品(批号100080-201408)购自中国食品药品检定研究院。

1.1.2主要仪器与试剂 TU-1810紫外分光光度计(北京普析)，GR-202电子天平(日本AND公司)，MS105分析天平(梅特勒公司)；盐酸、硫酸及无水乙醇(成都科龙)，亚硝酸钠(重庆江川)，硝酸铝(汕头西陇)，蒽酮(广东光华)，实验用水为纯化水。

1.2方法

1.2.1总酚酸的含量测定 (1)溶液的制备：取原儿茶醛对照品适量，加1 mol/L盐酸制成0.10 g/L的对照品溶液；取川参通注射液1 mL，置50 mL量瓶中，加1 mol/L盐酸至刻度，取上述溶液1.0 mL置10 mL量瓶中用1 mol/L盐酸至刻度，即得供试液。(2)线性关系：取对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8及1.0 mL分别置于10 mL量瓶中，加1 mol/L盐酸至刻度，1 mol/L盐酸作空白；于紫外分光光度计281 nm处测定吸光度，以标样浓度(mg/L)对吸收度(A)进行线性回归[12]。(3)精密度和稳定性：取对照品溶液0.7 mL，按照“(2)”项下重复测定5次，以峰面积计算精密度；取“(1)”项下稀释溶液1 mL，测定不同时间的吸光度[13]。(4)重现性试验：取同一批号(170909)川参通注射液，制备供试品溶液5份，重复测定5次，计算含量。(5)加样回收率：取注射液(总酚酸为2.053 g/L)0.5 mL，置50 mL量瓶中，加入1 mol/L的盐酸至刻度得样品稀释液；平行6次量取该稀释液1 mL，置10 mL量瓶中，加入0.10 g/L的对照品溶液0.2 mL，加入1 mol/L的盐酸至刻度作为供试品溶液，测定吸光度[14-15]。

1.2.2总黄酮的含量测定 (1)溶液的制备：取芦丁对照品适量，加60%乙醇制成0.207 g/L的对照品溶液；取川参通注射液1 mL，置25 mL量瓶中，加水至刻度，量取上述溶液1.0 mL至25.0 mL量瓶中，加水至6 mL，加5%亚硝酸钠溶液1 mL，放置6 min。加10%硝酸铝溶液1 mL，放置6 min；加氢氧化钠试液10 mL，再加水至刻度，放置15 min，作为供试品溶液[16]。(2)线性关系：取对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0及6.0 mL，分别置25 mL量瓶中，按照“(1)”项下方法制备，用水6 mL同法做空白；于紫外分光光度计500 nm处测定吸收度，以标样浓度(g/L)对吸收度(A)进行线性回归。(3)精密度和稳定性：取对照品溶液4.0 mL，按照“(2)”项下重复测定5次，以峰面积计算精密度；取“(1)”项下稀释溶液1 mL，测定不同时间的吸光度[17]。(4)重现性试验：取同一批号(170909)川参通注射液，制备供试品溶液5份，重复测定5次，计算含量。(5)加样回收率：取川参通注射液(总黄酮为18.3 g/L)0.5 mL，置25 mL量瓶中，加水至刻度得样品稀释液；平行6次量取1 mL上述液至25 mL量瓶中，加入0.207 g/L的对照品溶液2 mL，按照“(1)”项下方法制备，作为供试品溶液，测定吸光度[18]。

1.2.3单糖的含量测定 (1)溶液的制备：取无水葡萄糖对照品适量，加水制成0.305 g/L的对照品溶液；取川参通注射液1 mL，置25 mL量瓶中，加水至刻度，再取上述溶液1 mL，置25 mL量瓶中，加水至刻度得样品稀释液。再量取上述液0.5 mL至10 mL试管中，各加水至2.0 mL，加0.2%蒽酮硫酸溶液至刻度，作为供试品溶液[19]。(2)线性关系：取对照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4及0.5 mL，分别置于10 mL试管中，各加水至2.0 mL，加0.2%蒽酮硫酸溶液至刻度，于紫外分光光度计625 nm处测定吸收度，以标样浓度(mg/L)对吸收度(A)进行线性回归。(3)精密度和稳定性：取对照品溶液0.3 mL，按照“(2)”项下重复测定5次，以峰面积计算精密度。取“(1)”项下稀释溶液0.5 mL，测定不同时间的吸光度。(4)重现性：量取同一批号(170909)川参通注射液，制备供试品溶液5份，重复测定5次，计算含量。(5)加样回收率：取川参通注射液0.5 mL(单糖为53.1 g/L)，置25 mL量瓶中，加水至刻度，再取上述溶液1 mL，置25 mL量瓶中，加水至刻度。平行6次量取上述液0.5 mL至10 mL试管中，分别加入0.030 5 g/L的对照品溶液1 mL，各加水至2.0 mL，加0.2%蒽酮硫酸溶液至刻度，作为供试品溶液，测定吸光度[20]。

1.3统计学分析

使用Excel 2007版软件进行数据统计分析，计算精密度、稳定性、重现性、回收率的相对标准偏差(relative standard deviation，RSD)，线性分析采用最小二乘法，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1方法学考察

2.2含量测定

10批川参通注射液的总酚酸平均含量为2.05 g/L，其中最低含量为2.04 g/L，最高含量为2.06 g/L，各批次产品质量相对较为均一，总酚酸平均含量占川参通注射液固含物的2.53%，占比较低；10批川参通注射液的总黄酮平均含量为18.21 g/L，其中最低含量为17.92 g/L，最高含量为18.52 g/L，各批次产品质量相对较为均一，总黄酮平均含量占川参通注射液固含物的22.43%；10批川参通注射液的单糖平均含量为53.58 g/L，其中最低含量为52.91 g/L，最高含量为54.28 g/L，各批次产品质量相对较为均一，单糖平均含量占川参通注射液固含物的66.01%，占比最高。

表1 不同批号川参通注射液中总酚酸、总黄酮及单糖的测定结果

3 讨论

从10批川参通注射液的总酚酸、总黄酮和单糖的测定结果可以看出，厂家生产的成品批间均一性较好，不同批次间的差异性较小。3个大类成分中单糖含量最高，单糖测定中供试品的水解反应至关重要，通过比较最终选择蒽酮硫酸溶液作为反应试剂，结果稳定可靠，重现性好[22]。同时有报道硝酸铝与总酚酸所形成的络合物，其稳定性较差，通过比较不适合应用于川参通注射液中丹参总酚酸的测定，因此本实验选择盐酸法进行总酚酸的测定[23]。本实验运用紫外分光光度法对川参通注射液的总酚酸、总黄酮及单糖含量进行了测定，并对方法的精密度、稳定性、重现性以及加样回收率进行了考察，结果表明所建立的分析方法精密度、稳定性高，重现性、加样回收率好，符合定量分析要求。

测定波长的选择依据的是每个化学成分都在对应的波长下有特定的吸收，因此，选择测定波长时，应在一定的波长范围内扫描，选择有最大吸收峰的波长作为测定波长[24]。例如在黄酮类化合物的紫外吸收带中，不同的黄酮在统一吸收带中的吸收强度各不相同，异黄酮在黄芪总黄酮中所占的比例较大，通过大量的实践证实：使用紫外分光光度法测定特定波长下黄芪总黄酮的含量，不仅具备操作简便的特点，而且具备良好的重现性[25]。最终通过实验确定选择通过测定500 nm吸收值测定总黄酮的含量，通过测定281 nm吸收值测定总酚酸的含量，通过测定625 nm吸收值测定单糖的含量。

川参通注射液为国家二类新药，是目前临床上唯一用于良性前列腺增生症的纯中药注射剂，其局部靶向性的注射方式为产品疗效提供确切保障，近年来为本省经济发展做出了较大贡献。中药具有多成分、多靶点的治疗特点，单一的化学成分的含量已无法满足其质量控制要求[26]，因此大类成分的分析作为中药发挥药效的物质基础研究不可或缺。根据《中药注射剂安全性再评价质量控制要点》等文件中关于中药注射剂质量控制要点的规定，多成分制成的注射剂所测各类成分之和应大于总固体的80%[26]，本文在对川参通注射液大类成分研究时参考各药味化学成分及提取精制工艺，选取总酚酸、总黄酮及单糖为检测对象，涵盖了该品种所具有的大类物质基础，同时分别选取品种中所含的原儿茶醛、芦丁和D-无水葡萄糖为对照，大大增加了检测结果的可靠性，本文研究有利于川参通注射液的深入研究，为该品种的安全性再评价工作提供了有力的实验支撑。