液相色谱-质谱联用技术筛查synemin蛋白及其在肾癌诊断中的作用

谭文佳，杨照微，刘金华，孙志霞*

(吉林大学中日联谊医院 1.超声科;2.检验科，吉林 长春130033)

肾癌是最常见的泌尿系统恶性肿瘤，发病率逐年增加[1,2]。synemin(SYNM)是Ⅳ型中间丝蛋白，具有调节细胞运动、粘附和迁移的功能[3,4]，该蛋白质广泛表达于哺乳动物的中胚层和外胚层的收缩性细胞[5]。在Ⅳ级星形细胞瘤患者中高表达[6,7]，在肝癌[8]、结直肠癌[9]、乳腺癌[10,11]组织中低表达。

蛋白质组学技术广泛的应用于化学和医学领域，尤其是在对癌症的研究中，对我们进一步了解癌症的形成和发展具有重大意义[12]。本研究的目的是寻找肾癌组织和癌旁组织的差异蛋白，探索synemin蛋白成为肾癌生物标志物的可能性。利用液相色谱-质谱法鉴定肾癌和癌旁组织差异表达的蛋白，采用免疫组织化学的方法验证肾癌标本中synemin蛋白的差异表达。

1 材料和方法

1.1 研究对象

选择90例TNM Ⅲ期肾透明细胞癌患者。收集样本包括：术中获得新鲜的肾癌和配对的癌旁组织。PBS冲洗样本，液氮中保存。

1.2 试剂与仪器

蛋白质提取试剂盒、蛋白定量试剂盒、PBS粉剂购自美国赛默飞公司。二甲苯购自北京化工厂。LTQ XL 离子阱质谱仪购自美国赛默飞公司。电泳仪、电泳槽购自柏奥易杰北京科技有限公司。电子天平购自德国Mettler Toledo 公司。

1.3 实验方法

1.3.1提取样品总蛋白、测定蛋白浓度 从样本库中随机选取30例病理明确诊断为TNM Ⅲ期肾透明细胞癌患者的癌组织及癌旁组织标本随机分组(每组10例，共分为三组)。在实验条件不变的情况下，对三组样本进行3次重复实验。将上述分组的组织样本取出、剪碎，在液氮环境下研磨匀浆。称取0.1 g样本，置1.5 ml离心管。添加1 ml的裂解缓冲液，将混合物在冰浴中充分振荡、溶解。4 ℃，将离心机设置为12 000 g，离心1 h，分离上清液。分装样品，冷冻保存。

1.3.2样品蛋白水解多肽混合物 50 mM NH4HCO3溶液完全溶解样品，1M二硫苏糖醇溶液，使混合液C=20 mM，56 ℃，避光1 h。加入等体积的1 M碘代乙酰胺，使混合液C=50 mM，避光45 min。加入测序级胰酶(胰酶∶蛋白=1∶50)，常温静置。

1.3.3二维色谱-质谱联用技术分离、多肽混合物鉴定 0.1%甲酸溶液完全溶解样品，制备150 mm×0.32 mm强阳离子交换柱，串联150 mm×0.17 mm反相柱(30% Buffer B：0.1% FA，99% CAN)，流速2 μL/min，洗脱3 h，分离50 μg标本。乙酸氨洗脱强阳离子交换柱。LTQ XL离子阱质谱仪检测多肽混合物。

1.3.4生物信息学分析 对于获得的谱图进行数据库检索，纳入检索的谱图的标准为离子信号在10个或大于10个，强度等于或超过10个单位；使用的软件包为Bioworks 3.3.1 SP1，计算方法为SEQUEST算法；数据库为人蛋白质数据库3.51。

1.3.5免疫组化SP法染色

按试剂盒说明书进行操作。显微镜下观察synemin蛋白染色情况。按照黄褐、深黄、淡黄、无色，分别判为：3分，2分，1分，0分。按照阳性细胞数>75%、51%-75%、25%-50%、<25%、阴性，分别判为：4分，3分，2分，1分，0分。最终评分将两者相乘：≤3为低表达，>3为高表达。

1.3.6统计学分析

2 结果

2.1 肾癌和癌旁多肽化合物及差异蛋白的鉴定

根据液相色谱-质谱联用技术，对比分析肾癌和癌旁组织的差异蛋白，结合丰度和谱图数差异，结果证实：26个肾癌组织与癌旁组织差异表达的蛋白，18个在肾癌组织中显著过表达，8个在肾癌组织中显著低表达(见表1)。

表1 肾癌组织与癌旁组织差异蛋白

2.2 synemin蛋白的串联质谱鉴定

synemin蛋白部分序列肽段的串联质谱图见图1和图2。

图1 synemin蛋白的质谱鉴定：synemin-EALGLEQLR序列肽段的串联质谱图

图2 synemin蛋白的质谱鉴定：synemin-LQEALGAR序列肽段的串联质谱图

2.3 synemin蛋白在肾癌组织和癌旁组织的差异表达

通过免疫组化法发现，在胞浆中synemin蛋白表达较为常见。分析本研究中90例肾癌和癌旁组织synemin蛋白的表达，发现synemin蛋白在68.9%(62/90)肾癌组织中高表达，仅在46.7%(42/90)肾癌旁组织中高表达见表2。结果说明：synemin蛋白在肾癌组织中高表达，统计学差异明显(P<0.05)。

表2 对比肾癌与癌旁组织中synemin蛋白表达

3 讨论

蛋白质组学技术广泛的应用于医学领域，主要方法包括1H核磁共振(NMR)[13]，气相色谱-质谱(GC-MS)[14-16]，液相色谱-质谱法(LC-MS)[17-20]。质谱技术和液相色谱技术联合使用可以分析大分子蛋白[21]。最近研究表明[22,23]，LC-MS能更好地定向选择性识别低浓度的有机小分子。LC-MS现已广泛应用于蛋白质的表征和定性定量[24,25]。

本研究首先对临床样本进行预处理、检测样品总蛋白、测量浓度、二维液相色谱-质谱技术分析肾癌组织及配对的癌旁组织，对质谱数据进行生物信息学分析，发现肾癌和癌旁组织中的多肽混合物，建立了肾癌组织和癌旁组织的差异表达蛋白质谱。然后利用免疫组织化学方法检查收集的肾癌组织和癌旁组织，发现synemin蛋白绝大部分在胞浆中表达，其在肾癌组织中的表达水平明显高于癌旁组织，说明synemin蛋白在肾癌和癌旁组织中存在差异表达。从而预测synemin蛋白可能成为肾脏恶性肿瘤的生物标志物。