一株乳酸菌的分离鉴定及其在梨汁发酵中的应用

潘勇，李建宋，李静，廖祥儒，郝之奎*

(1.台州职业技术学院 应用生物技术研究所，浙江 台州 318000； 2.江南大学 生物工程学院工业生物技术教育部重点实验室，江苏 无锡 214122)

梨是最常见的大众水果之一，其营养丰富，不仅可口、多汁、解渴、抗疲，还有一定的保肝、通便、防癌抗癌等功效[1-2]。我国的梨树栽培面积和梨产量均占世界的五分之四，居世界首位，产量多年保持在1 600万t以上。《中国统计年鉴2018》显示，2016年我国梨产量达到1 870.4万t，主要集中在河北、安徽、新疆、河南及辽宁等省区，其中以河北、山东及新疆为代表的白梨和安徽、河南为代表的砂梨最为有名。安徽省砀山县是我国砂梨重要产区之一，和其他梨产区一样，由于加工水平较低，主要以鲜销为主，由于鲜梨上市集中特点且市场容量限制，滞销年年频现，丰产尤甚，发展砂梨深加工迫在眉睫[3-4]。利用现代生物技术开发鲜梨发酵饮料可有效提高梨附加值、丰富梨产品种类、提高深加工量[5]，也为砂梨产业的开发利用研究提供新的思路，具有较好的社会价值和经济价值。

本研究从梨树根际土壤中采集土样，利用加入溴甲酚紫指示剂的MRS培养基筛选产酸菌株，研究了该菌株的形态学和生理生化特征并通过16 S rRNA基因序列分析鉴定了该菌株为乳酸杆菌，将筛选菌株应用于梨汁发酵，优化了梨汁发酵工艺，分析了梨汁发酵前后主要成分的变化，初步探讨其在梨汁发酵饮料中的应用。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

植物根际土壤取自新疆哈密某梨园；砀山梨来源于市场新鲜采购；葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、酵母粉、胰蛋白胨、牛肉浸膏、CH3COONa、C6H14N2O7、K2HPO4、MgSO4·7H2O、MnSO4·4H2O、NaOH、HCl、吐温80 为普通试剂；细菌基因提取试剂盒和总抗氧化能力(T-SOD)试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

主要仪器有：旋转式恒温摇床，上海苏坤实业有限公司；超净工作台，苏净集团安泰公司；立式压力蒸汽灭菌锅，美国ZEALWAY公司；电热恒温鼓风干燥箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；紫外分光光度计UV-2000，美国UNICO公司；电子天平CP214，奥豪斯仪器有限公司；XP基因扩增仪，杭州博日科技有限公司；pH计STARTER3100，美国OHAUS公司；数控超声波清洗器，昆山禾创超声仪器有限公司；高效液相色谱仪Agilent 1260，美国安捷伦公司；高速离心喷雾干燥机GEA，Niro公司。

1.2 培养基

MRS培养基：葡萄糖20.0 g·L-1，酵母粉5.0 g·L-1，胰蛋白胨10.0 g·L-1，牛肉浸膏10.0 g·L-1，CH3COONa 5.0 g·L-1，C6H14N2O72.0 g·L-1，K2HPO42.0 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.58 g·L-1，MnSO4·4H2O 0.25 g·L-1，吐温80 1 mL·L-1，pH 6.2～6.6。MRS培养基中添加1.5%的琼脂粉为固体培养基。

PY基础培养基：胰蛋白胨5.0 g·L-1，酵母提取物10.0 g·L-1，酪蛋白水解物5.0 g·L-1，盐溶液40.0 mL·L-1。其中盐溶液成分为：NaCl 2.0 g·L-1，无水CaCl20.2 g·L-1，MgSO4·7H2O 0.48 g·L-1，K2HPO41.0 g·L-1，NaHCO310.0 g·L-1。

碳水化合物基础培养基：酵母粉2.5 g·L-1，胰蛋白胨 10.0 g·L-1，吐温80 0.1 mL·L-1，1.6%的溴甲酚紫乙醇溶液1.0 mL·L-1，碳水化合物溶液 50.0 mL·L-1。其中碳水化合物溶液分别取D-果糖、D-木糖、D-甘露糖、D-半乳糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、纤维二糖、L-鼠李糖、海藻糖、L-山梨糖、D-甘露醇、D-山梨醇、D-阿拉伯糖、棉子糖、肌酸、肌醇等各10 g溶于1 L水中，调pH至 6.5。

柠檬酸盐培养基(g/L或mL/L)：脱脂奶粉10.0 g·L-1，酪蛋白水解物2.5 g·L-1，葡萄糖5.0 g·L-1，琼脂15.0 g·L-1，溶液A 10.0 mL·L-1，溶液B 10.0 mL·L-1，pH 6.5，108 ℃灭菌12 min后冷却至45 ℃，然后加入溶液A和溶液B，混合均匀后倒平板，30 ℃避光干燥24 h备用。其中溶液A的配制方法如下：取10.0 g高铁氰化钾溶于100 mL去离子水中，100 ℃蒸汽加热灭菌30 min；溶液B的配制方法如下：分别取1.0 g柠檬酸铁和1.0 g柠檬酸钠共溶于40 mL去离子水中，100 ℃蒸汽加热灭菌30 min。

1.3 实验方法

1.3.1 菌株筛选

采用稀释涂布法处理富集培养液，30 ℃恒温箱倒置培养，至菌落长出；挑选变黄的菌落，划线分离直至获纯培养物。

1.3.2 菌株鉴定

观察30 ℃条件下培养24 h后的MRS固体培养基上菌落特征。革兰氏染色法染色待测菌，显微镜下观察研究形态学特征。依据《伯杰细菌鉴定手册》和文献[6-8]研究待测菌的过氧化氢接触酶实验、精氨酸水解实验、糖利用实验、柠檬酸钠利用实验、耐酒精实验、耐盐实验、产酸产气实验及七叶苷水解实验等生理生化特性。

利用细菌通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCT GGCTCAG-3′)和1492R (5′-TACGGCTACCTTGTT ACGACTT-3′)扩增细菌16S rRNA基因。在50 μL反应体系中加入DNA模板1 μL，27F引物1 μL，1492R引物1 μL，2×EasyTaqPCR SuperMix 25 μL，加水22 μL。PCR条件如下：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，35次循环；72 ℃延伸10 min；3%琼脂糖电泳检测，PCR扩增产物送到华大基因科技股份有限公司测序。

利用BLAST通过数据库http://blast.ncbi. nlm.nih.gov分析，构建系统进化树，找出与数据库同源性最高的已知菌种，推测菌株可能的属或种。

1.3.3 菌株生长特性研究

最适生长温度：利用MRS培养基研究20、25、30、35、40 ℃条件下温度因素对待测菌的影响，接种量为5%，60 r·min-1摇床培养24 h，测定D600值。

最适生长pH：利用MRS培养基研究pH值对待测菌生长的影响，pH值分别为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，接种量为5%，60 r·min-1摇床培养24 h，测定D600值。

生长曲线和产酸能力的测定：按接种量5%接种于MRS培养基中，30 ℃培养，摇床转速60 r·min-1，每2 h测定D值，根据文献[9]测定菌株产酸能力。

1.3.4 菌株在梨汁发酵饮料中的应用

发酵剂的制备：分别按4∶1、3∶2、2∶3、1∶4配制MRS/梨汁混合培养基，按接种量5%接种，在30 ℃，60 r·min-1条件下培养24 h，确认生长状况较好后，转接至含1%蜂蜜的梨汁中30 ℃发酵24 h得到梨汁的发酵剂。

待测菌发酵梨汁工艺流程：新鲜砀山梨去皮→粉碎打浆→护色(0.2%柠檬酸水)→过滤→灭菌(95 ℃，5 min)→冷却→接入发酵剂(接种量5%)→发酵(30 ℃，24 h，初始pH 6.5)→调配(蔗糖8%)→成品。

发酵工艺条件的优化：根据上述实验结果确定温度，依据发酵梨汁工艺流程，其他条件不变，分别以接种量(1%、3%、5%、7%、9%、11%)、培养时间(10、20、30、40、50、60 h)、蔗糖添加量(2%、4%、6%、8%、10%、12%)进行单因素实验，以感官评分为指标对各样本进行评价。

以接种量、发酵时间和蔗糖添加量为三因素，以感官评分为指标，作L9(33)正交实验。1～3水平，接种量分别为4%、5%和6%，培养时间分别为15、20和25 h，蔗糖添加量分别为5%、6%和7%。

依据国标等相关方法，随机挑选20位感官评价经验丰富人员参照标准对样品进行感官评定，每组数据去除一个最高分和一个最低分后取平均值作为该项目分值。感官评分标准：色泽0～20分，鲜明柔和，有光泽，无杂色，均匀一致；气味0～30分，有清新的梨香和乳酸味，无异味；滋味0～30分，酸甜适口，口感细腻，无不良气味；组织状态0～20分，流动性好，均匀不分层，微混浊，无杂质。

1.3.5 梨汁发酵前后主要成分的变化

氨基酸含量的测定：在最优发酵工艺条件下发酵梨汁，采用高效液相色谱法[10-11]测定发酵前后梨汁中总氨基酸、必需氨基酸及苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸等有机酸含量。

T-SOD、黄酮及VC含量的测定：发酵前后分别取样，制成10%的匀浆液，离心10 min(4 000 r·min-1)，取上清液分别根据试剂盒说明测T-SOD，依据GB/T 12143附录G测黄酮含量，采用紫外分光光度法[12]测VC含量。样本数量为3，取平均值作为检测结果。

2 结果与分析

2.1 菌株鉴定

2.1.1 菌株形态特征

筛选获得的纯培养菌落直径约3 mm，浅黄色，球形，中凸起，表面光滑，成对或链状排列，革兰氏阳性(图1)。

图1 菌株SYBC psL4菌落特征(左)和革兰氏染色照片(右)

2.1.2 菌株SYBC psL4生理生化特性

生理生化特性研究结果见表1，参照《伯杰细菌鉴定手册》，初步鉴定该纯培养物属于明串珠菌属，命名为SYBC psL4。

表1 菌株生理生化特性

2.1.3 菌株SYBC psL4 16S rRNA基因分析

PCR扩增纯培养基因组，产物凝胶电泳如图2，片段长度1 500 bp左右，无明显拖尾。测序后通过BLAST，与Leuconostocfallax16S rRNA基因序列同源性达100%。结合生理生化研究结果，确定该纯培养为欺诈明串珠菌，命名为LeuconostocfallaxSYBC psL4。

图2 菌株SYBC psL4 16S rRNA片段PCR扩增产物凝胶电泳

2.2 菌株SYBC psL4生长特性研究

2.2.1 菌株SYBC psL4的最适生长温度、最适pH

最适温度和最适pH研究结果分别是30 ℃和6.5(图3)。

图3 温度和初始pH对SYBC psL4生长的影响

2.2.2 SYBC psL4生长曲线和产酸能力的测定

如图4所示，SYBC psL4的停滞期在0～4 h，对数生长期在4～12 h，此阶段D值最高达到2.1，12 h后进入稳定期。SYBC psL4有较强的产酸能力，发酵12 h，pH值由6.5降至4.1，对数期产酸较多。

图4 菌株SYBC psL4的生长曲线和产酸能力

2.3 菌株SYBC psL4在梨汁发酵饮料中的应用

2.3.1 发酵工艺条件的优化

由图5可知，适当提高接种量可缩短延滞期，缩短发酵周期，感官评分随着接种量的增大呈现出先增高后降低的趋势。接种量为5%时，感官评分为87分，为最高值，接种量5.5%理论值最好。以4%、5%和6%的接种量作为正交实验的3个水平。培养时间在10～20 h时，发酵时间对发酵梨汁的感官影响较大，发酵20 h，感官评分达88分最高值，理论预测最好时间为22 h。随后，口感随酸度增加而下降。选择发酵时间15、20和25 h为正交实验的3个水平。添加蔗糖过少或过多会使梨汁偏酸或偏甜，影响梨汁饮料的酸甜感，感官随着蔗糖添加量增加得分先增后降，添加量为6%时得分最高。选择5%、6%和7%的蔗糖添加量为正交实验的3个水平。

图5 接种量、培养时间和蔗糖添加量对梨汁发酵的影响

正交实验结果如表2所示，发酵时间因素对感官影响最大，蔗糖添加量和接种量影响次之，最佳培养条件为发酵时间为25 h，蔗糖添加量为6%，接种量为5%。验证实验感官评分获92分。

表2 各因素组合对感官评分的影响

2.3.2 发酵前后主要指标的变化

由表3可知，总氨基酸含量在发酵后变化不明显，苏氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸(Leu)和赖氨酸发酵后含量稍增，甲硫氨酸含量比发酵前降低明显。

表3 梨汁发酵前后7种必需氨基酸变化

采用高效液相色谱测定了梨汁发酵前后的4种有机酸含量变化，结果显示发酵前后，梨汁的苹果酸和柠檬酸含量没有明显的减少，这与菌种不能代谢柠檬酸和苹果酸的生化特性保持一致，发酵产生了微量的乙酸，而乳酸含量在发酵后有明显的增加，说明发酵过程产生了大量的乳酸(图6)。

图6 发酵前后梨汁中有机酸含量变化

如表4所示，发酵后，T-SOD增加0.91%，无显著变化。黄酮含量增加29.83%，增加显著，VC的含量减少16.13%，可能发酵过程中代谢产生的乳酸，降低了pH值，保护了VC免受被氧化、分解[13]，部分VC作为底物被SYBC psL4发酵利用，转化为有机酸或其他维生素。

表4 梨汁饮料发酵前后成分变化

3 小结

对未知菌株进行鉴定至少同时用3种方法得到相同结论才可靠，本研究对利用稀释涂布平板法从梨根际土壤样本中分离获得的纯培养进行了形态学、生理生化和分子生物学研究，鉴定为一株欺诈明串珠菌，命名为LeuconostocfallaxSYBC psL4。欺诈明串珠菌可用于食品加工，本研究尝试利用该菌发酵了砀山梨汁，结果表明，发酵梨汁可获得较好口感的发酵产物，且对主要营养成分如氨基酸和T-SOD影响不大，对VC含量影响也有限，但是，通过发酵，乳酸和总黄酮含量显著增加，总体上看，通过发酵，较好改善了梨汁的营养结构，有一定的价值。和其他果品一样，梨上市集中，市场易滞销，梨的深加工水平和加工量亟待提高，目前，梨的加工形式主要是梨罐头和少量梨汁，梨发酵饮品较少，利用包括现代生物技术在内的科技发展成果提升梨深加工技术水平是实现梨产业快速发展的重要途径之一。