一种基于超高效液相色谱串联质谱同时测定大米中10种真菌毒素和杀鼠剂的检测方法

赵健，吕燕，许秀琴，吴银良

(宁波市农业科学研究院 宁波市农产品质量检测中心，浙江 宁波 315040)

杀鼠剂和真菌毒素是可能污染粮食的2类有毒有害物质。杀鼠剂在稻谷种植和储藏阶段被广泛应用，误用或处理不当都会造成粮食的污染[1-2]。真菌毒素在稻谷的生长过程中，尤其是在储藏过程中，被真菌不断地代谢出来，会造成粮食的污染。同时，部分真菌毒素还具有“三致”(致突变、致癌、致畸)作用[3-5]。因此，同时监测稻谷是否被杀鼠剂和真菌毒素污染，对保证粮食安全具有非常积极的意义。

目前，关于杀鼠剂和真菌毒素的检测方法在国内外已有报道[6-7]。其中，对杀鼠剂的检测多关注于血浆[8-9]、动物组织[10]、食品[11-13]等基质，对真菌毒素的检测多关注于粮食[14-15]、食品[16]、中药[17]、食品添加剂[18]等基质。总的来看，现有的检测方法多局限于杀鼠剂或真菌毒素单类药物，使用QuECHERS-超高效液相色谱串联质谱法同时测定杀鼠剂和真菌毒素的方法仍较少见。本研究基于现有研究基础，通过筛选和优化提取试剂、净化材料和液相质谱仪器条件，建立一套基于QuECHERS-超高效液相色谱串联质谱仪检测大米中10种药物(氯灭鼠、安妥、大隆、杀鼠灵、杀鼠醚、赭曲霉毒素A、赭曲霉毒素B、黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、玉米赤霉烯酮)的方法，旨在为粮食样品快速检测杀鼠剂和真菌毒素提供借鉴与参考。

1 材料与方法

1.1 试验仪器

XEVO TQ超高效液相色谱串联质谱仪(UPLC-MS/MS)，配电喷雾离子源(ESI)，美国Waters；N-EVAP-24氮吹仪，美国Organomation；PL3002电子天平、XPE205天平，Mettler Toledo；KS4000ic控温摇床，德国IKA；LM3310盘式实验粉碎磨，瑞典Perten。

1.2 试验试剂

甲醇、乙腈、甲酸，色谱纯，德国Merck；硅胶、N-丙基乙二胺(PSA)，上海安谱科学仪器；多壁碳纳米管，南京先丰纳米材料科技有限公司。

氯灭鼠、安妥、大隆、杀鼠灵、杀鼠醚购于德国Dr. Ehrenstorfer，赭曲霉毒素A(OTA)、黄曲霉毒素B2(AFB2)、赭曲霉毒素B(OTB)、黄曲霉毒素B1(AFB1)、玉米赤霉烯酮购于加拿大TRC，以上物质的纯度均大于95%。样品粉碎，-20 ℃储存。

1.3 溶液配制

储备液：称取适量固体标样，用乙腈溶解，配成100 mg·L-1的储备液，-20 ℃保存。

工作液：取储备液用基质空白依次稀释至适当浓度，现配现用。

提取溶液：乙腈-水-甲酸混合溶液，三者体积比为80∶19∶1。

1.4 样品提取与净化

称取粉碎后的大米样品2.50 g，置于50 mL塑料离心管中，加入10 mL提取溶液，放匀浆仪上12 000g匀浆2 min，振荡15 min后超声2 min，9 500g离心5 min。准确移取4.00 mL上清液至装有80 mg PSA的10 mL塑料离心管中，涡旋1 min，9 500g离心3 min，准确移取2.50 mL净化溶液于另一个10 mL试管中，在氮气流下40 ℃水浴浓缩近干，残液用1 mL乙腈-0.1%甲酸水溶液(体积比1∶1)共1 mL溶解，12 500g离心3 min，待测。

1.5 液相条件

色谱柱，Acquity UPLC BEH Shield RP18 2.1 mm×100 mm，1.7 μm；进样体积，10 μL；色谱柱温度，40 ℃；样品室温度，20 ℃；流动相A，乙腈；流动相B，0.1%(体积分数)甲酸水溶液。

梯度洗脱程序：0 min，流速0.4 mL·min-1，流动相A，20%(体积分数，下同)，流动相B，80%；1 min，流速0.4 mL·min-1，流动相A，20%，流动相B，80%；3 min，流速0.4 mL·min-1，流动相A，50%，流动相B，50%；5 min，流速0.4 mL·min-1，流动相A，90%，流动相B，10%；9 min，流速0.4 mL·min-1，流动相A，90%，流动相B，10%；9.1 min，流速0.4 mL·min-1，流动相A，20%，流动相B，80%；12 min，流速0.4 mL·min-1，流动相A，20%，流动相B，80%。

1.6 质谱条件

离子源，电喷雾离子源(ESI+和ESI-同时扫描)；检测方式，多反应监测；电离电压，2.50 kV；雾化气流速，1 000 L·h-1；锥孔气流速，30 L·h-1；离子源温度，150 ℃；雾化温度，500 ℃。各化合物的质谱条件如下：氯灭鼠，定性离子对343.0/120.9(m/z，下同)，定量离子对343.0/284.9，锥孔电压24 V，碰撞能量40、20 V；安妥，定性离子对203.1/127.3，定量离子对203.1/144.0，锥孔电压26 V，碰撞能量30、16 V；大隆，定性离子对521.3/78.9，定量离子对521.3/135.1，锥孔电压-68 V，碰撞能量-34、-38 V；杀鼠灵，定性离子对307.3/250.1，定量离子对307.3/161.0，锥孔电压-36 V，碰撞能量-18、-22 V；杀鼠醚，定性离子对291.2/106.0，定量离子对291.1/141.0，锥孔电压-42 V，碰撞能量-26、-28 V；OTA，定性离子对404.5/358.1，定量离子对404.5/239.1，锥孔电压25 V，碰撞能量25、14 V；OTB，定性离子对370.2/187.1，定量离子对370.2/205.1，锥孔电压22 V，碰撞能量36、18 V；AFB1，定性离子对313.2/241.1，定量离子对313.2/213.1，锥孔电压46 V，碰撞能量46、38 V；AFB2，定性离子对315.3/287.1，定量离子对315.3/259.1，锥孔电压46 V，碰撞能量28、24 V；玉米赤霉烯酮，定性离子对317.3/149.0，定量离子对317.3/175.0，锥孔电压-44 V，碰撞能量-20、-26 V。

2 结果与分析

2.1 方法优化

2.1.1 提取溶剂选择

大米样品含水量较少，提取溶液需加入水相以提高回收率。此外，10种药物均可溶解于乙腈和甲醇中，但它们结构差异较大，部分药物还含有酸碱性基团。为保证所有药物的回收率，采用在乙腈和甲醇中加入少量水或者甲酸水溶液作为提取液的思路。这样做也有利于浓缩，提高定量限。为此，通过试验考查了乙腈-水(体积比80∶20)、甲醇-水(体积比80∶20)、乙腈-水-甲酸(体积比80∶19∶1)、甲醇-水-甲酸(体积比80∶19∶1)4种提取溶液对10种药物的回收率和提取效果，并通过基质匹配的外标法进行计算。结果表明：当使用没有甲酸的提取溶液进行提取时，OTA和OTB等药物的回收率在50%以下；当使用含有甲酸的提取溶液进行提取时，所有药物的回收率均在70～120%。鉴于乙腈比甲醇能更好地去除大米中的蛋白质，最终选择乙腈-水-甲酸(体积比80∶19∶1)作为提取溶剂。

2.1.2 净化材料选择

净化过程，既要兼顾药物的回收率，又要考虑除去提取液中更多的杂质，减少基质效应和样液中杂质对仪器的污染。因大米含有丰富的糖和蛋白质，为取得较好的回收率，分别选用硅胶、PSA和多壁碳纳米管作为填料，以期使用简便的方式，取得较佳的净化效果。结果表明：以硅胶作为净化材料时，安妥、大隆等药物的回收率低于60%；以多壁碳纳米管作为净化材料时，AFB1、AFB2等药物的回收率低于50%，其他8种药物回收率均在70%以上；以PSA作为净化材料时，当4.00 mL乙腈-水-甲酸(体积比80∶19∶1)提取溶液中使用80 mg填料时净化效果最好，10种药物的回收率在70%～120%。

2.1.3 色谱条件优化

流动相的选择，关系到样品的分离度和离子化效果。10种药物的结构差异较大，需正、负离子同时扫描。为提高药物的电离度，得到更好的灵敏度，试验对比了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%甲酸水溶液、乙腈-0.1%甲酸水溶液4套体系，通过调整有机相和水相的梯度，使液相条件最佳。结果表明，甲醇、乙腈加水作为流动相时，OTA等几种药物的峰形较宽；而加入甲酸的流动相，10种药物均能得到较好的峰形。有机相为乙腈时，10种药物的灵敏度和峰形均优于以甲醇为有机相时，所以选择乙腈-0.1%甲酸水溶液体系。

2.1.4 质谱条件优化

根据10种药物的理化性质，大隆、杀鼠醚、杀鼠灵和玉米赤霉烯酮的电离化模式为ESI-，其他药物的电离化模式为ESI+。应用仪器自带的工作站自动优化质谱参数，最终建立10种药物的多反应检测扫描(MRM)方法。

2.2 方法学验证

2.2.1 基质效应

大米营养组分丰富，虽然提取溶液经过净化，但是样液中未净化杂质，仍有可能对药物产生基质效应，从而影响最终的检测结果。为验证上述方法最终上机溶液的基质效应，对用溶剂和基质空白分别配制的系列混合标准工作溶液进行比较，配制的系列浓度范围为2～100 μg·L-1。表1列出了10种药物的基质标液与溶剂标液线性回归方程的斜率比，结果显示，氯灭鼠、玉米赤霉烯酮等几种农药的斜率比超出0.8～1.2的阈值，说明大米样液中仍有较强的基质效应。为此，最终选择基质标液定量。

表1 溶剂标液和基质标液的线性回归方程和斜率比

2.2.2 定量限和线性关系

用大米基质空白配制10种真菌毒素和杀鼠剂的混合标液，质量浓度依次为2、5、10、20、100 μg·L-1。结果表明，当质量浓度为2～100 μg·L-1，10种药物的回归曲线的决定系数(R2)在0.991 0～0.999 8，线性关系良好。开展大米空白样品添加试验，以10倍信噪比时的添加浓度为方法定量限，结果如表2所示，10种药物的定量限在0.5～2.5 μg·kg-1。

2.2.3 回收率与精密度

称取不含10种真菌毒素和杀鼠剂的大米样品，添加混合标样，添加浓度(质量分数)分别为8、20、100 μg·kg-1，每个水平做5次平行。结果显示，10种药物的平均回收率为75.2%～110.0%，相对标准偏差为1.4%～10.7%(表2)。

表2 10种药物的添加回收率、相对标准偏差和定量限

3 小结

建立起一套可实现10种杀鼠剂和真菌毒素药物同时提取、QuECHERS方法同时净化、超高效液相色谱串联质谱仪同时检测的方法，经验证，所建立的方法简单，快速，重现性好，适用于大米中氯灭鼠、安妥、大隆、杀鼠灵、杀鼠醚、赭曲霉毒素A、赭曲霉毒素B、黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素B2、玉米赤霉烯酮等10种药物的定性定量快速检测。