间充质干细胞治疗视网膜疾病作用机制的研究进展*

连晓倩 徐国兴

(1.福建医科大学附属第一医院;2.福建省眼科研究所,福建 福州 350005)

0 引言

间充质干细胞(Mesenchymal stem cell ，MSCs)是中胚层来源的具有自我更新能力和多向分化潜能的成体干细胞，最初由Fridenstein等在骨髓中发现，此后，又发现了不同来源的MSCs，如脂肪组织(ADSC)、牙髓、脐带华通氏胶(huc-MSCs)、胎盘羊膜(hAD-MSCs)等[1]。MSCs是目前再生医学研究领域最热门的干细胞之一，具有神经营养作用、血管生成调节、免疫调节、抗炎、抗凋亡等多种功能。许多研究已经表明，MSCs在多种视网膜疾病的治疗中发挥重要作用，包括糖尿病视网膜病变、视网膜退行性疾病、脉络膜新生血管、视网膜缺血-再灌注等疾病。

1 MSCs治疗视网膜疾病作用机制的研究进展

MSCs发挥视网膜保护作用的机制多种多样，可能的主要机制是神经保护作用、免疫调节作用和血管生成调节作用，通过组合的方式修复或再生受损的视网膜组织，恢复视网膜功能。

1.1 神经保护作用

目前，较为大众所知的MSCs介导的视网膜神经保护功能，一方面是MSCs通过特定微环境的诱导生成视网膜神经样细胞，替代凋亡细胞；另一方面是MSCs通过旁分泌作用产生神经保护因子，如睫状神经营养因子(CNTF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、血小板源性生长因子(PDGF)和轴突生长相关蛋白-43(GAP-43)等[2-4]。此外，越来越多的证据表明，MSCs释放的细胞外囊泡具有治疗潜力[5-6]。根据其独特的生物学组成，细胞外囊泡可分为微囊泡、微颗粒或外泌体，它们在以旁分泌方式调节细胞间通信中发挥着重要作用[7]。MSCs来源的外泌体富含蛋白质、脂质和核酸。有研究发现，MSCs来源的外泌体在视网膜激光损伤的小鼠模型中具有修复和保护视网膜的作用。

近年来，出现另一种假说，即干细胞可将其自身的正常线粒体转移到周围线粒体受损的靶细胞，从而影响受损细胞的增殖、分化和衰老等过程。MSCs的线粒体转移已在角膜细胞、星形胶质细胞和神经细胞等多种细胞中发现[8-10]。当线粒体损伤时，ATP合成不足，导致RGCs轴突萎缩，视觉功能受损，如Leber遗传性视神经病变[11]。Jiang D等利用线粒体复合物I缺陷小鼠模型，即NDUFS4基因敲除小鼠模型，将诱导性多能干细胞源性间充质干细胞(iPSC-MSCs，用LV-mito-GFP标记线粒体)注射到小鼠玻璃体腔中，免疫荧光(IF)检测发现小鼠视网膜的RGCs中表达LV-mito-GFP阳性线粒体，并且RGC的存活率较对照组明显升高。说明iPSC-MSCs的线粒体能够转移到RGC中，并且对RGC具有保护作用[12]。

1.2 免疫调节作用

MSCs介导的免疫调节作用机制复杂，目前尚未完全阐明，可能的机制包括细胞-细胞间直接接触，以及分泌生物活性物质，如生长因子、细胞因子和趋化因子等。MSCs可以抑制多种细胞的功能，包括巨噬细胞、中性粒细胞、自然杀伤(NK)细胞、树突状细胞(DC)、B淋巴细胞和T淋巴细胞。例如，在体内和体外，MSCs都能诱导巨噬细胞向M2型极化，并通过分泌抑制性细胞因子IL-10和/或TGF-β等下调免疫应答[13]。MSCs通过限制MHCII、CD1-α、CD40、CD80和CD86的表达来抑制单核细胞向树突状细胞的分化，并限制DC细胞的成熟[14]。MSCs对T细胞增殖的抑制作用也已被证实。特别是，MSCs被证明可以抑制CD4+T细胞分化为促炎性Th1和Th17细胞系，并促进CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞(Tregs)的生成，从而改善破坏性炎症反应[15-16]。此外，MSCs还能调节中性粒细胞、NK细胞等，但目前这些方面的研究报道较少。

有趣的是，MSCs的免疫调节作用并不是天然固有的，研究发现，不同程度的炎症介质会诱导MSCs极化分型并表现出截然相反的免疫调节作用，即免疫抑制或促进，这一特性称为MSCs免疫调节的可塑性[17-18]。例如，在强炎症状态下，MSCs可以有效治疗移植物抗宿主病(GVHD)，但是若将MSCs在骨髓移植同一天输注，即炎症反应尚未开始时，则治疗效果不显著。Ren等[19]发现MSCs发挥免疫抑制作用需要高浓度促炎因子的“授权”，主要包括IFN-γ、IL-1α、IL-1β和TNFα等促炎细胞因子。当高浓度的促炎因子存在时，能显著提高MSCs分泌肿瘤坏死因子诱导基因6蛋白(TSG-6)、白细胞介素-1受体拮抗剂(IL-1Ra)、TGF-β、一氧化氮(NO)和吲哚胺2,3-氧合酶(IDO)等免疫调节因子的水平，从而发挥免疫抑制作用。而多种促炎因子同时存在可以产生协同增效作用[19]。究其原因，主要是低水平的炎症因子不足以诱导MSCs高表达NO和IDO等免疫抑制因子，反而会刺激MSCs分泌大量趋化因子，从而招募淋巴细胞至其周围，加剧炎症反应[20]。

1.3 血管调节作用

通过血管修复性细胞治疗，以取代或恢复受损的血管，正在成为干细胞治疗缺血性视网膜病变的新策略。已有研究表明，MSCs能够分化成内皮样细胞，对视网膜血管病变起保护作用[21-23]。除此之外，MSCs还可以分泌血管生成相关因子调节视网膜疾病的血管生成，如血管内皮生长因子(VEGF)，成纤维细胞生长因子(FGF)，肝细胞生长因子(HGF)和转化生长因子-b(TGF-b1)[24,25]。在氧诱导的视网膜病变小鼠模型中，研究者发现通过腹膜内移植的人胎盘羊膜来源的MSCs能有效归巢并移植到受损部位，并且释放血管生成相关因子，如TGF-β1[26]，TGF-β1水平的上调可以抑制内皮细胞增殖显著减少新生血管形成[26]。2016年，Ezquer等人报道了在糖尿病小鼠模型中，MSCs通过分泌血小板来源的抗血管生成因子——血小板反应蛋白-1(Thrombospondin Type-1,TSP-1)发挥细胞保护作用[27]。TSP-1是一种糖蛋白，在健康的眼部微环境中调节MSC功能，包括抗血管生成、抗炎、免疫调节和免疫赦免活动，主要是由眼表上皮细胞(包括RPE、脉络膜细胞和Muller胶质细胞)产生[27-29]。

然而，也有研究发现MSCs移植后眼中的病理性新血管反而加重。2010年的一项研究发现，骨髓来源的MSCs能选择性地迁移并移植到脉络膜新生血管旁，并进一步加重病理状况[30]，其可能与MSCs分泌VEGF有关，众所周知，VEGF可以刺激内皮细胞增殖和管状结构形成，是促进视网膜新生血管形成的关键因子。有研究发现，MSCs表达VEGF的多少与微环境中炎症蛋白的浓度有关，Ribot J等将大鼠骨髓来源的MSCs与内皮细胞共培养，发现当上清液中TNF-α和FGF浓度下降时，VEGF的表达也下降[31]。此外，BMSCs可分泌血小板反应蛋白-1(TSP-1)，TSP-1是一种功能强大的血管生成抑制剂，可通过Fyn和p38MAPK介导血管内皮细胞的凋亡[29]，此外TSP-1还可以通过招募特异性磷酸酶SHP-1到CD36-VEGFR2复合物中，从而抑制VEGF诱导的VEGFR2磷酸化和下游Akt信号通路[30]或下调基质金属蛋白酶(MMPs)的表达[31]来减少血管生成。MSCs是良好的基因载体，因此，可以通过基因修饰增强血管抑制因子的表达来抑制视网膜新生血管的生成[32,33]。

2 问题与展望

间充质干细胞由于没有伦理问题、易于分离和扩增以及低免疫原性的优势，已成为细胞替代治疗的一种有价值的工具。多项研究表明，MSCs对视网膜疾病的治疗有益，但其具体的作用机制尚不完全明确，目前研究较多的是MSCs分化为视网膜细胞的能力，旁分泌恢复性营养因子和细胞因子，发挥免疫调节作用和血管调节作用。但如何准确调控MSCs的分化时相、选择性分泌神经营养因子和抗血管生长因子，仍是治疗的难点。除此之外，由于视网膜疾病的复杂性，加上动物模型的局限性，以及尚未证实的人体临床试验安全性，也为MSCs治疗视网膜疾病的研究带来了不确定性。因此，对MSCs的研究任重而道远。