经皮迷走神经耳支刺激改善心力衰竭犬的心功能研究

赵利 苏玮 王坤

摘要：目的  探讨低强度经皮迷走神经耳支刺激（AB-VNS）治疗对心衰犬心功能改善情况的影响。方法  24只Beagle犬均植入起搏器，分成假手术组（n=8），心衰组（n=8），AB-VNS组（n=8）。假手术组仅植入起搏器但不起博;心衰组和AB-VNS组行起搏器起搏制作心衰模型，AB-VNS組给予低强度经皮耳迷走神经刺激治疗8周。心脏超声测量射血分数（EF）和左室舒张末期直径（LVEDD）;酶联免疫吸附法测定血清NT-proBNP、CRP和TNF-α浓度;电生理方法检测心率、ERP;取心肌组织做Masson染色观察心肌组织形态学改变。结果  经皮耳迷走神经刺激治疗8周后AB-VNS组的EF[（53.50±2.59）%]高于心衰组[（45.17±3.06）%]，LVEDD[（37.17±1.60）mm]小于心衰组[（53.83±6.15）mm]，差异有统计学意义（P<0.05）;AB-VNS组Nt-proBNP低于心衰组[（388.56±40.94）pg/ml vs （674.91±56.78）pg/ml]、CRP[（9.57±1.18）mg/L vs （9.57±1.18）mg/L]、TNF-α[（6.40±0.63）ng/L vs （10.82±0.88）ng/L]、静息心率[（124.17±7.30）bpm vs（146.67±8.14）bpm]，ERP较心衰组延长[（158.50±5.24）ms vs（125.17±4.83）ms]，差异有统计学意义（P<0.05）。AB-VNS组Masson染色示心肌细胞形态较规则，伴有少量胶原纤维。结论  低强度经皮迷走神经耳支刺激有助于提高心衰犬心射血分数、降低NT-proBNP和炎症因子，并减慢心率、延长有效不应期。

关键词：心力衰竭;迷走神经耳支;心功能;心衰犬

中图分类号：R541.6                                文献标识码：A                                  DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.11.018

文章编号：1006-1959（2020）11-0058-04

Abstract：Objective  To investigate the effect of low-intensity percutaneous vagal nerve branch stimulation （AB-VNS） on the improvement of heart function in dogs with heart failure.Methods  All 24 Beagle dogs were implanted with pacemakers and divided into sham operation group （n=8）， heart failure group （n=8）， AB-VNS group （n=8）. In the sham-operated group， only a pacemaker was implanted， but it was not worthwhile; the heart failure group and the AB-VNS group were paced to make a heart failure model， and the AB-VNS group was given low-intensity percutaneous ear vagus nerve stimulation treatment for 8 weeks. Cardiac ultrasound measures ejection fraction （EF） and left ventricular end-diastolic diameter （LVEDD）; enzyme-linked immunosorbent assay to determine serum NT-proBNP， CRP and TNF-α concentration; electrophysiological methods to detect heart rate， ERP; take myocardial tissue for Masson staining was used to observe the morphological changes of myocardium.Results  After 8 weeks of percutaneous ear vagus nerve stimulation treatment， the EF [（53.50±2.59）%] in the AB-VNS group was higher than the heart failure group [（45.17±3.06）%]， and the LVEDD [（37.17±1.60） mm] was smaller than the heart failure group [（53.83±6.15）mm]， the difference was statistically significant （P<0.05）; AB-VNS group Nt-proBNP was lower than heart failure group [（388.56±40.94） pg/ml vs （674.91±56.78） pg/ml]， CRP [（9.57±1.18） mg/L vs （9.57±1.18） mg/L]， TNF-α [（6.40±0.63） ng/L vs （10.82±0.88）ng/L]， resting heart rate [（124.17±7.30） bpm vs （146.67±8.14） bpm]， ERP was longer than heart failure group [（158.50±5.24） ms vs （125.17±4.83） ms]， the difference was statistically significant （P<0.05）. Masson staining in AB-VNS group showed that the shape of myocardial cells was regular， with a small amount of collagen fibers.Conclusion  Low-intensity percutaneous vagus nerve branch stimulation can help increase heart ejection fraction， reduce NT-proBNP and inflammatory factors， and slow heart rate and prolong the effective refractory period in dogs with heart failure.

Key words：Heart failure;Vagus nerve ear branch;Heart function;Heart failure dog

心力衰竭（heart failure）简称心衰，是各种心脏疾病的共同终末结局，也是最主要的死亡原因，目前已成为严重威胁人类健康的一大类疾病。调节自主神经失衡的状态，可以改善心衰的症状，干预自主神经成为心衰治疗的研究方向。通过增强迷走神经活性，与交感神经建立新的平衡状态，可作为心衰治疗的手段之一。本研究运用起搏器起搏制作Beagle犬心衰模型，给予经皮迷走神经耳支刺激（auricular branch of the vagus nerve stimulation，AB-VNS）8周，分析低强度迷走神经刺激改善心衰犬的心功能情况，现报道如下。

1对象与方法

1.1研究对象  健康Beagle犬（8～12周龄），体重（12.21±2.66）kg，雌雄不拘。实验设计及实施均经过新医大一附院动物伦理委员会审核批准。根据随机数字表法将实验犬分为3组，假手术组（n=8），心衰组（n=8），AB-VNS组（n=8）。由有经验的专业人士定时喂养。

1.2持续快速起搏右心室致心衰犬模型的建立  本实验采用物理埋藏式高频起搏器起搏（250次/min）右心室诱发犬心衰，用低频维持心衰（190次/min）、10周后建立充血性心衰模型。行微创开胸术，均植入起搏器。假手术组：植入起搏器但不起博;心衰组和AB-VNS组植入起搏器并起搏制作心衰模型。心衰模型成功后，心衰组不予以经皮迷走神经耳支刺激，AB-VNS组给予低强度经皮耳迷走神经刺激8周。

1.3经皮迷走神经耳支刺激心衰犬  本实验用远程控制系统监测犬的血压、心率。左/右耳屏用2个鳄鱼夹每隔1 d给予2 h电刺激，每次一侧刺激        2 min，间隔2 min，刺激对侧，左/右侧交替刺激，共8周，刺激强度为80%的阈值电压（刺激频率20 Hz、低强度电压0.5～1 V，脉宽1 ms）。刺激的电压阈值是达到窦房传导速度减慢20%以上的最低电压。在刺激过程中用Lead7000记录体表心电图。

1.4心电图记录及心室刺激  将多极电极缝合到心室的自由壁以给出程序化的心室刺激，并通过LEAD 7000（Lead 7000，Jinjiang Electronics，China）記录体表ECG。进行程序化刺激以确定心室有效不应期（Ventricular Effective refractory period，VERP），并将ERP定义为未能做出反应的最长S1-S2间期。基础心脏周长S1S1为300 ms，刺激率比为8∶1，步长为-10 ms。测量了3次后取平均为最终的ERP。

1.5超声心动图检查心脏形态和功能  在动物清醒状态下行超声心动图检查，在二维超声引导下用M超声进行心脏功能和大小的测量，所得到的计量资料连续测量3个心动周期后取其平均值。测量左室舒张末内径（LVEDD）和左室射血分数（EF），EF≤50%作为判断心衰发生的指标。

1.6 Masson染色观察犬心室肌病理改变  各实验组犬左心室组织（1 mm×3 mm～1 mm×5 mm）用10%福尔马林固定，经过石蜡包埋切片：①石蜡切片脱蜡至水，自来水和蒸馏依次水洗;②将切片用Regaud苏木精染液染核5～10 min;③将切片充分水洗，若过染可盐酸酒精分化，酒精分化后再蒸馏水水洗;④先将切片用Masson 丽春红酸性复红液室温下泡5～ 10 min;⑤将切片用2%冰醋酸水溶液浸洗几秒钟，然后用1%磷钼酸水溶液分化3～5 min;⑥将切片直接用苯胺蓝5 min，以0.2%冰醋酸水溶液浸洗几秒钟;⑦用95%酒精、无水酒精、二甲苯透明、中性树胶等材料封固。取玻片覆盖，显微镜下观察组织像。

1.7血清学指标测定  采集腹壁静脉或者耳静脉血约5 ml， 室温静置30 min，3000 r/min离心10 min，将血清分装于EP管中，于-80 ℃冷冻保存，通过酶联免疫吸附法测定N末端脑钠肽前体（N-Terminal pro-Brain Natriuretic Peptide、Nt-proBNP）、C-反应蛋白（C-reactive protein，CRP）和肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α，TNF-α）水平。

1.8统计学处理  应用统计学软件SPSS 25.0处理实验数据。计量资料以（x±s）差表示，组内比较采用配对资料的t检验，组间比较采用独立样本t检验。计数资料以（n）表示。P<0.05表示差异有统计学意义。

2结果

2.1三组Beagle犬心脏超声结果分析比较  心衰组EF基线水平及8周后水平均低于假手术组，差异有统计学意义（P<0.05）;心衰组LVEDD基线水平及8周后水平均高于假手术组，差异有统计学意义（P<0.05）; 8周后，AB-VNS组的EF高于心衰组，差异有统计学意义（P<0.05）;AB-VNS组的LVEDD小于心衰组，差异有统计学意义（P<0.05），见表1。

2.2三组Beagle犬血清学指标结果比较  心衰组基线水平和8周后的Nt-proBNP、CRP和TNF-α均高于假手术组，差异有统计学意义（P<0.05）。治疗8周AB-VNS组Nt-proBNP、CRP、TNF-α均低于心衰组，差异有统计学意义（P<0.05），见表2。

2.3三组Beagle犬基线水平和8周后心率和ERP结果比较  心衰组基线水平和8周后静息心率均高于假手术组，心衰组基线水平和8周后ERP均低于假手术组，差异有统计学意义（P<0.05）。8周后AB-VNS组的静息心率低于心衰组、ERP高于心衰组，差异有统计学意义（P<0.05），见表3。