血培养中病原菌的耐药性及耐碳青霉烯肠杆菌科细菌的耐药基因研究*

彭 超，孟凌云，夏鹏程，薛庆节，陈 廷

(1.济南大学/山东省医学科学院医学与生命科学学院，山东济南 250200；2.济宁市第一人民医院检验科，山东济宁 272001；3.泰安市中心医院检验科，山东泰安 271000；4.济宁医学院基础学院，山东济宁 272001)

随着血培养技术在疾病的精准治疗中发挥着越来越重要的作用，细菌培养鉴定和耐药性分析也逐渐得到临床重视。阳性标本中肠杆菌科细菌占据较高比例，而碳青霉烯类抗菌药物，如亚胺培南、美罗培南和厄他培南，是临床治疗肠杆菌科细菌引起的感染最有效的抗菌药物。但是，随着碳青霉烯类抗菌药物应用范围及剂量频繁加大，导致肠杆菌科碳青霉烯耐药率呈现逐年上升趋势[1]。众所周知，耐碳青酶烯肠杆菌科细菌(CRE)耐药机制复杂，在国内，肠杆菌科细菌的碳青霉烯酶基因分离率较高[2]，且耐药菌株携带碳青霉烯酶基因主要为KPC和NDM-1。本研究对济宁市第一人民医院血培养阳性标本中病原菌的分布及耐药性进行分析，并重点检测CRE的耐药基因，以便为临床科学使用抗菌药物提供强有力的理论指导，预防CRE多重耐药菌株的产生及传播。

1 材料与方法

1.1菌株来源 采用BD全自动血培养仪分离2017年12月至2018年12月9 258份临床血培养标本中非重复病原菌共675株。

1.2仪器与试剂 美国BD全自动血培养仪Bactec FX，德国西门子公司MicroScan WalkAway 96 PLUS型全自动细菌鉴定分析仪，依据CLSI 2012年的标准判读结果。试剂使用与仪器配套的相应培养基、鉴定卡。巧克力平板(郑州安图生物有限公司)，MH琼脂培养基(英国Oxoid公司)，哥伦比亚血琼脂平板(郑州安图生物有限公司)，E-test条(法国bioMerieux)，药敏纸片(10 μg，英国Oxoid公司)，普通琼脂糖(西班牙Biowest Agarose公司)，goldview核酸染料(北京世纪康为公司)，乙二胺四乙酸(EDTA)缓冲液(青岛科尚生物公司)，Taq酶(青岛科尚生物公司)。

1.3质控菌株 金黄色葡萄球菌ATCC25923、粪肠球菌ATCC29212、大肠埃希菌ATCC25922、肺炎克雷伯菌ATCC700603、铜绿假单胞菌ATCC27853和白色念珠菌ATCC66027均购自国家卫生健康委员会临床检验中心。

1.4方法

1.4.1细菌鉴定及药敏试验 参照《血培养检测规范化操作》[3]进行标本的正确采集，并将其快速置于血培养仪中进行连续震荡培养和检测，仪器报警有阳性瓶时，取出后无菌操作抽取培养液，立即革兰染色做初级报告，并快速转种血平板、巧克力平板、麦康凯平板等进行五区划线方式培养，待其菌落生长良好备用。采用德国西门子WalkAway 96 PLUS自动化微生物鉴定仪NC50复合板进行细菌鉴定及药敏试验。仪器未报警阳性，同时进行涂片显微镜检查和培养，显微镜检查可有效避免漏检厌氧菌和苛养菌，若有细菌生长，则进一步行菌株鉴定。检测方法分析性能验证参照文献[3-5]。

1.4.2耐碳青霉烯表型筛选方法 根据2018年美国临床和实验室标准协会(CLSI)的更新，改良碳青霉烯灭活试验(mCIM)用于检测肠杆菌科细菌和铜绿假单胞菌中的碳青霉烯酶，而EDTA改良碳青霉烯灭活试验(eCIM)是与mCIM联合使用以区分产金属酶和丝氨酸碳青霉烯酶的肠杆菌科细菌。mCIM可以单独进行实验，但eCIM必须同时和mCIM联合进行实验。仅当mCIM结果呈阳性时，eCIM结果才有效。

1.4.3PCR检测相关耐药基因 PCR反应条件：灭菌双蒸H2O 31.75 μL，缓冲液5.00 μL，dNTP 4.00 μL，引物F 2.00 μL，引物R 2.00 μL，Tap酶0.25 μL，模板5.00 μL；95 ℃预变性持续1 min→95 ℃变性持续45 s→57 ℃退火复性持续45 s→72 ℃延伸45 s(需要35个循环)→72 ℃延伸10 min结束。引物序列[6-7]见表1。

表1 PCR扩增引物序列

续表1 PCR扩增引物序列

1.5统计学处理 采用WHONET5.6软件进行耐药及分布统计分析。

2 结 果

2.1主要致病菌种类 675株阳性菌中，排在前3位的分别为大肠埃希菌161株(23.85%)、肺炎克雷伯菌55株(8.15%)、人葡萄球菌46株(6.81%)。见表2。

表2 血培养675株主要病原菌种类

2.2病原菌分布 革兰阴性(G-)杆菌的分离率(58.00%)高于革兰阳性(G+)杆菌(42.00%)。其中，189株(28.00%)来自重症监护病房(ICU)，79株(11.70%)来自儿内科病房。见表3。

2.3抗菌药物敏感试验结果 161株大肠埃希菌对亚胺培南等16种抗菌药物的敏感率为36.0%～99.4%，55株肺炎克雷伯菌对亚胺培南等16种抗菌药物的敏感率为60.0%～98.2%。其中大肠埃希菌及肺炎克雷伯菌对亚胺培南、美罗培南及厄他培南3种碳青霉烯类抗菌药物的敏感率较高，均在98.0%以上。见表4。

表3 血培养675株病原菌科室分布情况

表4 血培养主要G-杆菌药物敏感性结果(%)

2.4耐碳青霉烯表型筛选结果 对675株非重复分离病原菌中2株CRE进行表型验证，2株细菌mCIM均阳性，确定其均产碳青霉烯酶，其中大肠埃希菌eCIM阳性，产金属酶；肺炎克雷伯菌eCIM阴性，产丝氨酸碳青霉烯酶。

2.5耐碳青霉烯基因检测结果 通过PCR方法检测其相关耐药基因，并对其阳性基因进行测序，结果检出1株产NDM-1型金属酶和KPC-gp、KPC-qc型碳青霉烯酶的大肠埃希菌及1株产KPC-gp、KPC-qc型碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌。见表5。

表5 耐碳青霉烯酶相关基因PCR结果

注：+表示阳性；-表示阴性。

3 讨 论

本研究结果显示，2017年12月至2018年12月济宁市第一人民医院共送检血培养标本9 258份中，检出非重复病原菌675株，阳性率为7.3%，低于张红霞等[8]报道的10.4%，这可能与标本送检率、培养条件和地区差异有关。675株阳性菌中G-杆菌的分离率明显高于G+杆菌，排在前3位的分别为大肠埃希菌161株(23.85%)、肺炎克雷伯菌55株(8.15%)、人葡萄球菌46株(6.81%)。由于济宁市第一人民医院G+杆菌比例较高，怀疑与标本的污染存在直接关系，凝固酶阴性葡萄球菌为血培养污染的主要细菌，血培养标本的污染也是不可忽视的重大问题，这就要求检验科人员结合C-反应蛋白、血清淀粉样蛋白A、降钙素原、白细胞总数、中性粒细胞数及亚硝酸盐等感染指标，对结果进行评估鉴定，降低误诊率。

血培养阳性标本多分布于感染高发科室，排在首位的是ICU(189株，28.00%)。ICU血培养阳性率高首先考虑其抗菌药物使用问题，患者感染重，早期临床医生经验用药在所难免，但如果药物应用不合理，极易导致患者菌群失调，使患者出现条件致病菌感染；其次ICU作为相对封闭的科室，加大了医院内感染可能，尽管医务人员严格执行手卫生等医院内感染管理要求，也不能完全避免院内感染的可能；最后ICU的患者多数运用体外支持、导尿、插管等有创操作，增加了血流感染的概率。排在第2位的是儿内科病房(79株，11.70%)，究其原因包括：儿科患儿普遍年龄较小，抵抗力较差，屏障系统发育不完善，病原菌易经局部感染入血，造成血流感染；儿科病房重视血培养标本采集，发热患儿入院后及时送检标本，阳性率高。一般来说，临床上对碳青霉烯类抗菌药物耐药的细菌比较少见，肠杆菌科细菌对碳青霉烯类抗菌药物有较高的敏感性，研究报道显示医院内感染G-杆菌中占比较多的是大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌和铜绿假单胞菌等[9-10]。本研究中，G-杆菌阳性率前2位分别为大肠埃希菌(161株)及肺炎克雷伯菌(55株)，由此可见济宁市第一人民医院肠杆菌科细菌感染相对严重，与李华信等[11]报道的结果相似。其中，大肠埃希菌的抗菌药物敏感率为36.0%～99.4%，对碳青霉烯类抗菌药物敏感率(99.4%)高，这与北京协和医院相似[12]。肺炎克雷伯菌的抗菌药物敏感率为60.0%～98.2%，对碳青霉烯抗菌药物敏感率高(98.2%)。本研究结果说明，济宁市第一人民医院目前大多数肠杆菌科细菌对碳青霉烯类抗菌药物敏感性较高，耐药性相对较低。但值得注意的是院内已发现了2株CRE菌株，提示临床应重视对CRE的分离和监测数据，并根据实验室检测结果合理选用抗菌药物。

碳青霉烯酶可以水解大部分β-内酰胺酶，包括A类酶：NMC-A、IMI、SME(染色体介导)、KPC和GES(质粒介导)；B类酶：金属酶和NDM-1；D类酶：OXA和KPC。肠杆菌科细菌对碳青霉烯类抗菌药物的耐药性也是全球威胁临床医疗的重大问题之一。本研究通过PCR法对耐碳青霉烯抗菌药物的菌株进行碳青霉烯酶耐药基因筛选，结果显示分别为产NDM-1型金属酶和KPC-gp、KPC-qc型碳青霉烯酶的大肠埃希菌，以及产KPC-gp、KPC-qc型碳青霉烯酶的肺炎克雷伯菌。NDM-1型金属酶于2008年首次被发现[13]，可高效水解广谱β-内酰胺类抗菌药物，可由染色体、质粒或转座子介导，其由质粒编码，通过水平基因转化结合到其他细菌中，导致细菌的耐药性传播[14]。KPC酶属Ambler分类的A类，是一种由质粒介导的丝氨酸β-内酰胺酶，其利用丝氨酸残基的活性，且自身具有广泛的水解活性，可分解头孢菌素类、β-内酰胺类、氨曲南和碳青霉烯类抗菌药物[15]。抗菌药物的选择不仅使耐药基因广泛扩散，而且可促进耐药基因变异，进而使耐药性发生改变[16]。本课题组既往的试验亦证实，与碳青霉烯酶相关的耐药基因可以通过质粒在细菌之间传递，并且导致细菌耐药性的变化[17]。本研究结果显示，济宁市第一人民医院已经出现CRE，耐药基因分型分析显示其耐药机制主要为携带NDM-1型金属酶和KPC-gp、KPC-qc型碳青霉烯酶，然而是否存在耐药基因的垂直传播还有待进一步研究。

4 结 论

基于本研究分析结果，济宁市第一人民医院血流感染形势不容乐观，首次从院内血培养中发现CRE，并且基因测序明确证实其耐药性是由碳青霉烯酶耐药基因所致。为此需要严格地按照指南标准进行抗菌药物的选择，加强医院内感染管理控制，重视细菌耐药监测的必要性，创造安全、良好的就医环境。