CIBERSORT反卷积算法计算胃腺癌免疫浸润的研究*

安覃景，梁成通#，李玉武，李思思，韩崇旭,3△

(1.大连医科大学研究生院，辽宁大连 116044；2.江苏省苏北人民医院临床检测中心/扬州大学临床医学院临床检测中心，江苏扬州 225001；3.扬州大学医学院研究生院，江苏扬州 225001)

胃腺癌由于其隐匿性强且症状不明显，被发现时大多处于晚期阶段，是导致患者病死率高、存活率低的常见癌症之一[1]，其对人类寿命和工作损失均有较大的影响[2]。免疫治疗作为新型的癌症治疗方式，其将药物作用于浸润较高的免疫细胞可最大程度地提高患者的临床生存率[3]。由于技术限制，免疫浸润的研究局限于非常狭窄的免疫应答领域，通常仅包括一种或两种细胞类型。CIBERSORT是一种利用反卷积算法来预测细胞占比的工具，它可基于标准化的基因表达数据来计算复杂免疫组织的细胞构成，且能量化特定细胞类型的丰度。流式细胞分选术和免疫组织化学技术很好地验证了其可成功评估乳腺癌组织和肝癌组织免疫细胞的组成，且有研究运用该方法对肾癌、前列腺癌等疾病的免疫细胞进行了计算，发现了癌症免疫治疗发展的潜在靶点和生物标志物，可有助于开发新的免疫疗法[3-6]。本研究运用CIBERSORT工具对胃腺癌样本中的免疫细胞进行分析，以期为胃腺癌的免疫精准治疗提供新思路。

1 资料与方法

1.1一般资料 本研究中所有RNA相关数据及临床资料均来源于TCGA数据库(http://cancergenome.nih.gov)，且完全符合其出版指南。共纳入348例患者，包含343份癌症样本和30份正常样本。研究人群临床特征如下：男218例(62.64%)，女130例(37.36%)；生存状态中存活207例(59.48%)，死亡140例(40.22%)，未注明状态1例(0.30%)；年龄≤60岁108例(31.03%)，>60岁236例(67.82%),未注明的4例(1.15%)；种族中白种人218例(62.64%)，亚洲人68例(19.54%)，未注明的51例(14.66%)，黑人或非裔美国人10例(2.87%)，土著夏威夷人或其他太平洋岛民1例(10.29%)。

1.2研究方法 本研究采用Perl脚本对RNA相关数据和临床资料进行统计分析，得到矩阵文件，应用R软件(版本3.5.2)中的“limma”包对其进行矫正。采用CIBERSORT反卷积算法估计癌症组织中不同免疫细胞占比，并分析胃腺癌组织和正常癌旁组织中免疫细胞的差异性。运用R软件(版本3.5.2)中的“survival”包对免疫细胞进行生存分析和临床相关性分析。

1.3统计学处理 本研究使用CIBERSORT反卷积算法对肿瘤组织中不同免疫细胞占比进行分析。所有的数据均采用R软件(版本3.5.2)进行统计学分析，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1CIBERSORT反卷积算法计算不同免疫细胞占比 本研究共涉及22种免疫细胞的类型，包括初始B细胞、记忆性B细胞、浆细胞、CD8 T细胞、初始CD4 T细胞、未活化CD4记忆T细胞、活化CD4记忆T细胞、滤泡辅助性T细胞、调节性T细胞、T细胞、未活化NK细胞、活化NK细胞、单核细胞、M0巨噬细胞、M1巨噬细胞、M2巨噬细胞、未活化树突状细胞、活化树突状细胞、未活化肥大细胞、活化肥大细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞等。

本研究采用CIBERSORT反卷积算法对数据库中胃腺癌的肿瘤样本及正常样本进行分析发现，肿瘤样本中未活化CD4记忆T细胞、CD8 T细胞、M2巨噬细胞和M0巨噬细胞的平均占比最高，即免疫浸润最明显，其占比分别为15.90%、12.67%、11.81%和12.05%。同时笔者对这两种不同类型的样本中的免疫细胞进行差异分析，结果表明浆细胞、单核细胞、活化CD4记忆T细胞、M0巨噬细胞、M1巨噬细胞和M2巨噬细胞在正常样本和肿瘤样本中的占比比较，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1。此外，本研究通过分析全部样本中免疫细胞间的相关性发现，CD8 T细胞和未活化CD4记忆T细胞之间呈负相关(r=-0.53，P<0.05)，而中性粒细胞和活化肥大细胞之间呈正相关(r=0.45，P<0.05)。

图1 免疫细胞差异分析的小提琴图

2.2生存分析 本研究采用R软件中的“survival”包对存在生存数据的163份肿瘤样本和13份正常样本进行生存分析后发现，未活化CD4记忆T细胞高表达的有96份样本，低表达的80份样本，免疫浸润中低表达的未活化CD4记忆T细胞可有效提高生存率(P=0.029)，而CD8 T细胞高表达的有90份样本，低表达的86份样本，免疫浸润中高表达的CD8 T细胞可有效提高生存率(P=0.002)。见图2。

2.3临床相关性分析 通过研究分析不同免疫细胞与肿瘤临床分级的关系发现，未活化树突细胞和CD8 T细胞随着胃腺癌分级的增加浸润会逐渐增加，差异有统计学意义(P<0.05)。而T细胞、M0巨噬细胞、活化肥大细胞和中性粒细胞随着分级的增加浸润会逐渐减少，差异有统计学意义(P<0.05)，见图3。

注：A为未活化CD4记忆T细胞与生存率的关系；B为CD8T细胞与生存率的关系。

图2 免疫细胞的生存分析

注：A为免疫浸润的未活化树突细胞分数与临床分级的关系；B为免疫浸润的M0巨噬细胞分数与临床分级的关系；C为免疫浸润的活化肥大细胞分数与临床分级的关系；D为免疫浸润的中性粒细胞分数与临床分级的关系；E为免疫浸润的CD8 T细胞分数与临床分级的关系；F为免疫浸润的T细胞分数与临床分级的关系。

图3 胃腺癌免疫浸润细胞分数与临床分级的关系

3 讨 论

临床上缺乏诊断胃腺癌的特异性肿瘤标志物是导致胃腺癌患者病死率高、存活率低的主要原因[7]。此外，胃腺癌的治疗方式以手术切除和放化疗为主，但这会对正常组织产生不良反应，且预后效果不甚理想[8]。近年来，肿瘤免疫成为癌症治疗的新方向，其与临床特征密切相关，且可预估肿瘤的免疫浸润作为抗癌药物使用的标准[9]。免疫应答的特征在于拥有许多以高度协调的方式相互作用的特化细胞类型。CIBERSORT是一种计算机方法，用于识别来自大量组织样本的高维基因组数据中感兴趣的细胞亚群的表面特征，它可通过组织细胞混合物中的基因表达数据重建原始细胞的类型和数量，其对细胞和组织无损伤性，准确性较高，逐步在临床上得到应用[10-11]。

近年来，多项对胃癌的研究表明，T细胞和巨噬细胞在胃癌的发展进程中发挥着重要作用[12-14]。目前研究中CD4 T细胞以抗肿瘤效应为主，而CD8 T细胞对肿瘤的效应的研究结果不一致。LI等[15]的研究表明，肿瘤浸润的CD4 T细胞能够识别癌症相关抗原，通过白细胞介素-12或干扰素-γ的产生，生成Th1细胞并刺激M1巨噬细胞，且肿瘤体积越小，外周血中活化CD4 T细胞(P=0.003)和CD8 T细胞(P=0.002)的表达水平越高[15]。OKITA等[12]指出活化CD4 T细胞在抗肿瘤免疫反应中发挥显著作用，所以其会在肿瘤组织中明显增加。WEI等[13]指出CD8 T细胞可溶解并杀死肿瘤细胞，但THOMPSON等[16]认为CD8 T细胞是与肿瘤中PD-L1表达相关的适应性免疫的核心，且肿瘤免疫基质内CD8 T细胞密度的增加可能与肿瘤百分比的增加有关(P=0.027)。而本研究结果表明，未活化CD4记忆T细胞、CD8 T细胞在肿瘤组织中的平均占比高，这两种细胞之间存在明显负相关，最重要的是低表达的未活化CD4记忆T细胞与高表达CD8 T细胞可有效地提高患者的生存率。由此可以得出，未活化CD4记忆T细胞、CD8 T细胞在胃腺癌组织中呈现高表达，但其表达程度不一，甚至可能存在相互抑制的现象。未活化CD4记忆T细胞在肿瘤组织中转化为活化CD4 T细胞不足，是其不能发挥明显抗肿瘤效应的主要原因；而CD8 T细胞则可能具有较高的抑癌潜能，其可能作为免疫治疗的靶标以期应用于临床，但尚需更深入的研究以证实。

巨噬细胞分为M0、M1和M2 3种状态，在宿主防御和促进炎性反应方面均发挥重要作用。ZHANG等[14]指出，巨噬细胞可激活间充质干细胞获得肿瘤相关的成纤维细胞样特征，从而导致胃上皮细胞损伤及恶性转化。CHEN等[17]认为活化的间充质-上皮转换因子可通过外泌体转移到巨噬细胞中，并由其内化，而幽门螺杆菌感染可通过此种方式在巨噬细胞和胃癌细胞之间建立反馈环，可能导致癌症的发生。MUKHTAR等[18]研究表明巨噬细胞的M1与M2状态具有显著差异，M1巨噬细胞通过激活适应性免疫系统来促进抗肿瘤反应，而肿瘤细胞可吸引M2巨噬细胞，从而促进肿瘤细胞生长和扩散，巨噬细胞亚型之间的相互转换可能会成为肿瘤治疗的关键。本研究结果表明，M2巨噬细胞和M0巨噬细胞在肿瘤组织中平均占比较高，且3种巨噬细胞在肿瘤组织中的表达量均明显高于正常组织，即免疫浸润均明显。同时随着分级的增加，M0巨噬细胞的表达量逐渐降低。因此，可以得出巨噬细胞的表达量与胃腺癌密切相关，其可能会导致正常细胞获得肿瘤的特性，且随着分级的增加，M0巨噬细胞在癌症组织中被大量激活为M2巨噬细胞，少部分被激活为M1巨噬细胞，导致具有肿瘤免疫抑制功能的M2巨噬细胞表达量较高，而具有抗肿瘤反应的M1巨噬细胞表达量相对较低，这种状况会加剧癌症的扩散和转移，使患者病情逐渐加重。此外有研究表明，白细胞介素-17培养的巨噬细胞可通过B7-H1来抑制肝细胞癌患者的CD8 T细胞功能[19]。由此说明，巨噬细胞在肿瘤免疫浸润发挥着重要作用，其甚至可能会对体液免疫和细胞免疫均产生影响，M2巨噬细胞和M0巨噬细胞可能可以作为胃腺癌免疫治疗的靶标，为免疫精准治疗提供依据。

浆细胞、单核细胞、树突状细胞、活化肥大细胞、中性粒细胞也是肿瘤免疫中的重要组成部分，对胃腺癌的发展和预后具有显著影响[20]。浆细胞是由B淋巴细胞分化而来，可分泌IgG类抗体。SAITO等[21]的研究表明血清IgG水平的降低与胃癌患者预后不良密切相关，并且其与淋巴结转移有关，甚至可作为胃癌进展到晚期的标志。本研究结果表明，浆细胞在正常样本中的表达量明显高于肿瘤样本，其可能与肿瘤的发展进程有关，抗体介导的免疫反应可能会在胃癌患者中受损，由此导致浆细胞在肿瘤组织中的表达量降低，并会导致患者预后不良。单核细胞为巨噬细胞前体，在肿瘤细胞发挥炎症效应作用，进而造成在肿瘤组织中表达量的下降。活化肥大细胞在炎性反应中发挥着重要作用，但活化肥大细胞在肿瘤发展过程中的作用目前尚不清楚。一方面，它通过引起急性免疫应答，可能有助于限制肿瘤的发展[22]，另一方面，其可通过释放蛋白酶及与其他免疫效应物的相互作用来参与细胞间基质的降解，并且在异常免疫应答中，还可有效抑制适应性抗肿瘤免疫[23]。本研究的结果表明，中性粒细胞和活化肥大细胞之间呈正相关，且随着分级的增加，这两种细胞的表达量均呈降低趋势，这说明它们可随着肿瘤微环境的改变来调节自身表达量，但仍需深入研究以阐述其具体机制。中性粒细胞和树突细胞都在炎性反应时发挥重要作用，WEI等[13]认为树突状细胞可以作为抗原呈递细胞参与抗肿瘤免疫反应。SCHUSTER等[24]指出中性粒细胞在感染过程中对树突状细胞活化的影响不明，且其可能会延迟免疫反应的开始；OKITA等[12]的研究结果表明，胃癌细胞诱导的N2型中性粒细胞也可促进免疫抑制树突细胞的形成。中性粒细胞在胃腺癌的进展过程中逐渐被消耗，而树突状细胞不再受到中性粒细胞的免疫抑制，其表达量逐渐增加。因此，浆细胞、单核细胞、树突状细胞、活化肥大细胞、中性粒细胞均在胃腺癌肿瘤免疫中发挥着重要作用。

4 结 论

免疫细胞浸润在胃腺癌的发展过程中起着重要作用，笔者通过CIBERSORT分析免疫细胞占比发现，未活化CD4记忆T细胞、CD8 T细胞、M2巨噬细胞和M0巨噬细胞在肿瘤浸润和预后过程中发挥了重要作用，从而更好地为临床免疫精准治疗提供有效的依据。