杨雪娇,杨欢,焦芳艳,2a,尹铁球,2b
(1.湖南中医药大学临床医学院,长沙 410007;2.湖南省脑科医院 a.临检中心,b.检验科,长沙 410007)
铜绿假单胞菌是一种常见的机会致病菌,是引起免疫力低下患者细菌感染的常见病原体,由于碳青霉烯类抗菌药物的临床广泛使用,该类药物耐药株不断增加,导致铜绿假单胞菌感染易反复发作,且难以控制[1-2]。铜绿假单胞菌对碳青霉烯类药物发生耐药的原因多样,产碳青霉烯酶是最常见的原因之一[3]。酶基因易被可移动元件携带,进而造成耐药因子的播散。
近年来,越来越多的研究发现,整合子在介导铜绿假单胞菌从单一耐药向多重耐药转变过程中发挥了重要作用[4-6]。整合子是一种可移动遗传元件,存在于细菌染色体或质粒中,可以捕获多种耐药基因,使细菌耐药性在同种细菌或异种菌属间发生水平转移,使细菌具有多重耐药性[7-10]。在目前已经发现的6种类型耐药整合子中,由于Ⅰ类整合子携带耐药基因盒种类多、宿主广泛,故成为引起细菌间耐药性播散的重要原因之一[11-12]。故本研究以亚胺培南/美罗培南耐药的铜绿假单胞菌为研究对象,依据美国临床和实验室标准协会(Clinical Laboratory Standards Institute,CLSI)标准检测碳青霉烯酶,探讨铜绿假单胞菌与Ⅰ类整合子的相关性,现报道如下。
1.1菌株来源及鉴定 选取2018年10月至2019年2月湖南省脑科医院临床分离的110株非重复铜绿假单胞菌。入组菌株经全自动细菌鉴定仪鉴定,根据CLSI 2018版标准[13]中亚胺培南或美罗培南的最低抑菌浓度判断药敏检测结果,其中最低抑菌浓度≥8 μg/mL,判定为碳青霉烯耐药铜绿假单胞菌(Carbapene-resistant pseudomonas aeruginosa,CRPA);最低抑菌浓度≤2 μg/mL,判定为碳青霉烯类敏感铜绿假单胞菌。质控菌株为标准菌株ATCC 27853和ATCC 25922,均选自卫生部门临床检验中心。
1.2仪器与试剂 实验仪器包括全自动细菌鉴定仪(法国梅里埃公司,型号:VITEK-2 compact);JUNYI电泳仪(北京君意东方电泳设备有限公司,型号:JY600C);凝胶成像仪(美国柯达公司,型号:Gel Logic 212);超微量分光光度计(美国赛默飞世尔科技有限公司,型号:NanoDrop Lite)。试剂包括美罗培南药敏纸片(英国Oxoid公司,批号:2408075);细菌DNA提取试剂盒(美国Omega公司,批号:00D3350010000G20R079);Premix Ex Taq试剂盒(日本TaKaRa公司,批号:AI51239A);100 bp DNA Ladder(北京Solarbio公司);引物由上海生工及湖南擎科公司合成。
1.3方法
1.3.1碳青霉烯酶的检测 ①改良Hodge法:依据2017年CLSI标准[14],首先调制0.5麦氏浊度大肠埃希菌ATCC 25922的菌悬液,按1∶10稀释;然后按照纸片扩散法步骤将稀释后菌液涂布于MH平板上,干燥3~10 min后贴美罗培南纸片,最后将待测菌垂直于药敏纸片,从纸片边缘向平板边缘划线(20~25 mm),在35 ℃条件下孵育16~20 h。结果判读标准为待测菌在抑菌圈内呈现矢状生长者为阳性。②改良碳青霉烯灭活法(modified carbapenem inactivation method,mCIM):依据2019年CLSI标准[15],用10 μL接种环将满环过夜生长待测菌落接种于2 mL胰蛋白胨大豆肉汤中,充分涡旋振荡10~15 s后,向每支试管中加入一片含10 μg美罗培南的无菌纸片,在35 ℃条件下孵育4 h。孵育即将结束时,立即调制0.5麦氏浊度ATCC 25922菌悬液,菌悬液制备后必须在15 min内涂布于MH平板上,干燥3~10 min;将美罗培南纸片从胰蛋白胨大豆肉汤中取出,控干多余液体后贴在已涂布ATCC 25922的MH平板上,随后在35 ℃条件下孵育18~24 h。结果判读标准如下。a.碳青霉烯酶阳性:没有抑菌圈或抑菌圈直径6~15 mm,或抑菌圈直径16~18 mm,但抑菌圈内有散在菌落;b.碳青霉烯酶阴性:抑菌圈直径≥19 mm;c.碳青霉烯酶中性:抑菌圈直径为16~18 mm,或抑菌圈直径≥19 mm,但抑菌圈内有散在菌落,无法判定是否产生碳青霉烯酶。
1.3.2Ⅰ类整合子的检测 采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)技术检测 Ⅰ 类整合子。①制备DNA模板。参考提取细菌DNA试剂说明书提取细菌DNA,使用超微量分光光度计检测模板纯度,A260/A280在1.7~1.9,于-20 ℃冰箱中保存备用。②扩增整合酶基因。PCR反应体系为25 μL,Premix Ex Taq 12.5 μL,模板DNA 0.7 μL,上下游引物各0.8 μL(引物序列见表1[16]),RNase Free ddH2O 10.2 μL;配置反应体系在冰上进行,以减少核酸降解。反应条件:95 ℃预变性5 min,95 ℃变性30 s,52.5 ℃退火30 s,72 ℃延伸1 min,共35个循环,72 ℃延伸10 min。扩增后产物经1.5%琼脂糖凝胶在100 V恒压下电泳30 min,经凝胶成像仪扫描后观察结果。
表1 Ⅰ类整合子及可变区引物序列[16]
1.3.3可变区的检测 可变区PCR反应体系为25 μL:Premix Ex Taq 12.5 μL,上述Ⅰ类整合子阳性菌株的基因组DNA为模板DNA 0.7 μL,上下游引物各0.8 μL,RNase Free ddH2O 10.2 μL;配置反应体系在冰上进行,以减少核酸降解。反应条件:95 ℃预变性5 min,95 ℃变性30 s,58 ℃退火30 s,72 ℃延伸60 s,共35个循环,72 ℃延伸10 min。扩增后产物经1.5%琼脂糖凝胶在100 V恒压下电泳50 min,经凝胶成像仪扫描后观察结果。
1.4统计学方法 采用SPSS 22.0统计软件进行数据处理,计数资料比较采用χ2检验,相关性计算列联系数,P<0.05为差异有统计学意义。
2.1碳青霉烯酶检测结果 110株临床分离的铜绿假单胞菌中,经VITEK-2 compact细菌鉴定仪以及药敏试验检出CRPA 39株,其中15.38%(6/39)表现为mCIM法和改良Hodge试验同步阳性,仅1株表现为mCIM法阳性,部分实验结果见图1。
2.2Ⅰ类整合子检测结果 Ⅰ类整合子检出率为19.09%(21/110),其中碳青霉烯类敏感株Ⅰ类整合子的检出率为9.86%(7/71),耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌Ⅰ类整合子的检出率为35.90%(14/39),差异有统计学意义(χ2=11.049,P=0.002),见表2。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳Ⅰ类整合子的扩增产物为457 bp左右,与目的条带大小一致,见图2。
2.3PCR检测可变区 以检出的21株Ⅰ类整合子阳性菌株基因组DNA为模板扩增可变区,结果显示,57.14%(12/21)可变区成功扩增,可变区片段长度为800~4 500 bp,大小不等,见图3,其中碳青霉烯类敏感株可变区检出率为2.82%(2/71),而碳青霉烯类耐药株可变区检出率为25.64%(10/39),差异有统计学意义(χ2=13.493,P<0.01)。
mCIM:改良碳青霉烯灭活法;CRPA:耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌;2、6、8、16、18、20为菌株编号,其中2、16为mCIM法和改良Hodge试验阳性
表2 Ⅰ类整合子在碳青霉烯耐药组与碳青霉烯敏感组中的分布差异 (株)
PCR:聚合酶链反应;M:标志物Marker;-:阴性对照;+:阳性对照;2、16、20、23为菌株编号
PCR:聚合酶链反应;M:标志物Marker;-:阴性对照;20、23、41、56、67、71、81、87、88、90、93、115、273、283为可变区阳性株
2.4Ⅰ类整合子与碳青霉烯酶的关系 在39株CRPA中,7株检出碳青霉烯酶铜绿假单胞菌,且均携带Ⅰ类整合子,碳青霉烯耐药铜绿假单胞菌产碳青霉烯酶与Ⅰ类整合子的携带具有一定相关性(r=0.530,P<0.01),见表3。
表3 39株CRPA中Ⅰ类整合子与产碳青霉烯酶菌株的分布情况 (株)
铜绿假单胞菌是医院感染的主要病原菌之一,常引起皮肤黏膜、呼吸道、泌尿道等感染。碳青霉烯类药物是临床治疗铜绿假单胞菌感染的常用抗菌药物,具有抗菌谱广、抗菌活性强的特点[17],但随着碳青霉烯类药物的广泛应用,铜绿假单胞菌对碳青霉烯类药物的敏感性不断下降。据2017年全国细菌耐药监测网统计,在革兰阴性菌分离榜中,铜绿假单胞菌感染居第三位,其对碳青霉烯类药物的耐药率平均为20.7%[18]。本研究中,CRPA的检出率为35.45%,提示湖南省脑科医院铜绿假单胞菌的感染形势依然严峻,故需严密监测和减少铜绿假单胞菌感染,以避免铜绿假单胞菌的院内大规模感染。因此,探讨不同地区CRPA耐药性及整合子耐药基因的表达,并分析其耐药机制,以指导临床科学用药和控制院内感染[19-21]。CRPA的耐药机制主要包括产生碳青霉烯酶、孔蛋白突变、MexA-MexB-OprM外排泵超表达等,其中碳青霉烯酶的产生是CRPA耐药的重要原因之一[22-23]。本研究结果显示,17.95%(7/39)临床分离的CRPA为产碳青霉烯酶,说明碳青霉烯酶是导致湖南省脑科医院铜绿假单胞菌对碳青霉烯类药物耐药的原因之一。
铜绿假单胞菌的耐药机制复杂,整合子作为一种可移动的遗传元件,是介导细菌耐药的重要因素之一。有研究显示,与未携带Ⅰ类整合子菌株相比,携带Ⅰ类整合子菌株对多数抗生素的耐药率较高,提示Ⅰ类整合子在铜绿假单胞菌耐药形成中发挥着重要作用[24]。本研究中,Ⅰ类整合子在碳青霉烯类敏感株与碳青霉烯类耐药株的分布差异有统计学意义,Ⅰ类整合子的检出率为19.09%(21/110),与上述文献报道趋势一致。此外,本研究中,7株产碳青霉烯酶的铜绿假单胞菌均携带了Ⅰ类整合子,CRPA产碳青霉烯酶与Ⅰ类整合子的携带具有一定相关性(P<0.01),提示湖南省脑科医院铜绿假单胞菌碳青霉烯类耐药可能与Ⅰ类整合子携带相关耐药基因盒密切相关;有57.14%(12/21)的Ⅰ类整合子阳性菌株成功扩出可变区,且可变区片段均较大,多在3 000~5 000 bp附近,提示Ⅰ类整合子整合的耐药基因较多,可能携带除碳青霉烯酶以外的其他类型耐药基因盒,从而加速细菌耐药性的播散及流行;其中,93号菌株存在两条独立条带,可能携带了不同类型的整合子或不同的耐药基因盒。
本研究结果显示,Ⅰ类整合子和碳青霉烯酶的携带在铜绿假单胞菌对碳青霉烯酶类耐药甚至多重耐药中发挥了重要作用,两者具有中度一致性。但本研究样本量较小,仍需进行大样本量各类整合子分析,通过基因测序技术分析可变区相关耐药基因盒的携带情况,从而进一步明确铜绿假单胞菌的耐药性机制。
综上所述,研究期间湖南省脑科医院铜绿假单胞菌对碳青霉烯类耐药可能与Ⅰ类整合子携带相关耐药基因有关。应继续严格实施抗生素管理制度、加强院内感染监测,进一步完善整合子的相关研究。