卵母细胞的脱颗粒时间对短时受精后胚胎质量和妊娠结局的影响*

彭礼繁 张小建 廖梅旭 李晓洁 余 鲲 龙华洋

四川省医学科学院·四川省人民医院辅助生殖医学中心（四川成都 610072）

使用短时受精进行体外受精(IVF)时，卵子脱颗粒细胞时间何时为最佳目前尚存在争议[1]。脱颗粒细胞过早可能会增加胚胎的多精受精率，影响胚胎基因表达与基因甲基化修饰，进而影响胚胎质量；脱颗粒细胞时间过晚可能导致少数患者受精失败，失去补救卵胞浆内单精子显微注射Intracytoplasmic sperm microinjection(ICSI)的最佳时机。本研究观察了IVF 去除颗粒细胞和保留颗粒细胞发育的胚胎的发育参数，为短时受精及早补救ICSI 周期移植胚胎的选择提供参考依据。

资料与方法

一、研究对象

回顾性分析了2018年1月～2018年12月在我院行IVF 短时受精第3 天移植的323 例不孕患者的临床资料。患者纳入标准：（1）年龄25～35 岁；（2）获卵数为5～15 枚；（3）病因为女方不孕且男方精液正常。将患者按照卵母细胞不同的脱颗粒时间分为A组103 例和B组220 例，A组年龄(33.51±4.34)岁；B组年龄(32.43±4.23)岁。

二、研究方法

1. 促排卵及取卵：选择本中心常规的促排卵方案，包括激动剂长方案和拮抗剂方案，使用卵泡刺激素（FSH，果纳芬，默克雪兰诺，瑞士）进行卵巢刺激。当有3 个卵泡直径达到18～20mm 时注射human choionic gonadotophin (HCG)（艾泽，250μg/ 支，Serono，瑞士）250μg，此后38h 经阴道超声引导下取卵。

2.受精方法：取卵后3h 左右进行双井皿法授精。内井中为1mL 的G-IVF(Vitrolife)，加入10000～20000条精子(精液处理均为密度梯度法)，加入卵子10 枚左右。精卵共孵育3.5h 后用巴氏德吸管随机取出5 枚左右卵母细胞，使用剥卵针(COOK)轻轻吹打去除卵子周围部分颗粒细胞，置于新鲜培养液微滴中(G-IVF)中观察第二极体出现情况；若＞50% 的卵母细胞出现第二极体则判定受精成功。将剩余的卵母细胞保留颗粒细胞从内井液滴移出，放入另一新鲜的培养液中继续培养(G-IVF)。受精后20h 后使用剥卵针(COOK)全部去除颗粒细胞，观察受精情况，并进行原核评分。

3.胚胎的观察和评估：IVF 后的16～18h (受精后第1 天)观察卵母细胞的受精情况，并换液，继续用卵裂期培养基培养，第3 天观察卵裂球的分裂情况，根据胚胎卵裂球数目、 细胞质均一性、 碎片多少等进行胚胎评分，我们将卵裂球数目为6 或8，评级为II 的胚胎定义为优质胚胎。在移植日挑选质量最好的1～2 枚胚胎进行移植，其他胚胎转移至囊胚培养液（G2，Vitrolife，瑞典） 中继续培养。如果移植当日因特殊情况不能移植者，将此1～2 枚胚胎冷冻保存或继续培养。在受精后第5日或第6日观察囊胚形成情况，挑选内细胞团质量达到A 或B 级的囊胚进行冷冻，C 级的囊胚放弃，滋养细胞层的质量不限。

4. 妊娠结局的判断及观察指标： 移植后第7日检测血清HCG 水平，HCG>5U/L 判断为生化妊娠； 移植后4 周行超声检查，超声下可见胎心及胎囊者判断为临床妊娠。种植率＝着床胚胎数/ 移植胚胎数×100%；临床妊娠率＝临床妊娠例数/移植周期数×100%。

5. 分组标准：根据移植胚胎来源分组：A组为移植受精后3h 去除颗粒细胞的患者，B组为移植受精后3h并在20h 去除颗粒细胞的患者。

三、统计学方法

采用SPSS 22.0 软件进行统计学分析。数据以均数±标准差或率(%)表示，组间两两比较采用t 检验或卡方检验。P<0.05 为差异有统计学意义，P<0.01 为差异有极显著统计学意义。

结 果

1.患者基本情况比较

两组患者在年龄、不孕年限、原发/继发比例、促性腺激素用量、促性腺激素使用天数、获卵数、移植日内膜上均无统计学差异(P>0.05)。结果见表1。

2.患者的胚胎质量及妊娠结局比较

两 组 患 者 在MII 卵 数、2PN 卵 数、1PN 卵 数、2PN分裂数、优质胚胎数、移植胚胎数等胚胎发育参数方面两组间没有显著性差异（P>0.05）；但在3PN 卵数上两组间差异极显著（P<0.01），在种植率和临床妊娠率上两组间差异显著（P<0.05）。结果见表1。

讨 论

卵母细胞周围包裹着的大量颗粒细胞，参与构成卵母细胞发育的微环境。两者为结构和功能上的统一整体，涉及复杂的双向信号传导系统和分子水平机制，颗粒细胞对卵母细胞的发育成熟有重要作用，同时调控受精及胚胎发育过程，大量研究表明颗粒细胞的一些基因能够预测胚胎发育潜能及临床妊娠结局[2]。单卵母细胞的颗粒细胞的Growth differentiation factor-9(GDF-9) 与Bone morphogenetic protein-15(BMP-15)mRNA 能够评价卵母细胞的质量和预测卵母细胞发育潜能[3]。有研究认为[4]将未成熟卵母细胞与卵丘颗粒细胞共培养能够促使卵子体外成熟，从而增加优质胚胎数，改善妊娠结局，减少周期取消率。有研究结果[5]表明，将MI 期和GV 期卵母细胞与颗粒细胞共同培养后能够增加总成熟率，MI 期来源获得的优质胚胎率较高，表明颗粒细胞共培养能够促进卵母细胞的核质同步化。目前辅助生殖技术使用控制性超促排卵在非生理状态下募集较多的卵泡发育，可能会影响卵子的质量，损害线粒体功能，影响细胞骨架，从而导致卵母细胞的核质发育不同步，其核的成熟先于质的成熟。

表1 两组患者的临床资料和胚胎发育质量比较

体外受精实验结果表明[6]，就人和动物的卵母细胞恢复减数分裂和受精后的发育潜能而言，有颗粒细胞包围的卵母细胞明显高于无颗粒细胞包围的卵母细胞，有较多颗粒细胞包围的卵母细胞高于只有少量颗粒细胞包围的卵母细胞，这也表明颗粒细胞能提供卵母细胞成熟所必需的物质，并且这种物质依赖于颗粒细胞包围卵母细胞的数量和范围。有研究认为[7]，颗粒细胞可以分泌对早期胚胎发育有利的物质，如生长因子等；其可作为共培养细胞促进胚胎的发育；也可以通过代谢去除胚胎体外微环境中的不利于胚胎发育的物质，如重金属二价离子等。有研究认为[8]，颗粒细胞与卵母细胞之间存在的细胞间复杂的缝隙连接机制，对卵泡的发育及胚胎的质量都非常重要。关于短时受精早去除颗粒细胞对胚胎基因表达与甲基化修饰的影响以及颗粒细胞对胚胎后期发育潜能和着床率的影响，目前还无定论[9]。

有研究认为[10]，常规IVF 短时受精后6h 通过剥除颗粒细胞来观察第二极体是否排出可以预测卵子受精与否，通过早补救ICSI 可以有效地预防卵子受精失败，从而提高临床妊娠率。有研究认为[11]，脱颗粒细胞的时间过早会导致胚胎的多精受精率比例偏高。其原因可能是：在受精早期，过早脱颗粒细胞的机械操作很可能对卵母细胞外周的透明带造成损伤，如果造成透明带上的微小缺口，这会影响卵胞浆内的皮质反应和透明带反应，从而增加多精入卵的机会；颗粒细胞上的某些特有成分可以降低多精受精率，如果过早去除颗粒细胞会使其微环境发生改变，也可能增加多精受精的机会。这与本文的研究结果一致。此外，在配子形成早期，生殖细胞被抹除甲基化印迹，在精卵成熟过程中重新甲基化获得印迹，并被保护以维持其正确的剂量效应。印迹基因的甲基化等表观遗传修饰主要发生于配子发育阶段，而此期恰为短时受精的脱颗粒细胞时期，过早剥除颗粒细胞，是否增加对卵母细胞的额外影响，干扰卵母细胞或早期胚胎中母亲基因印迹的建立和维持，这还有待于进一步的研究[12]。

有研究对常规IVF 与短时受精的胚胎发育参数进行了比较，发现短时受精不能提高胚胎着床率和临床妊娠率[13]，另外一些研究的结论则与之相反[14-15]。本研究比较了短时受精后去除颗粒细胞与保留颗粒细胞所发育的胚胎发育参数和妊娠结局，结果显示：移植短时受精后20 h 去除颗粒细胞发育的胚胎与短时受精后3h去除颗粒细胞发育的胚胎着床率和临床妊娠率之间有统计学差异。这也提示了卵母细胞周围的颗粒细胞不仅与配子受精有重要关系，而且对胚胎的后期发育潜能也具有重要意义，这也为移植时胚胎选择提供了一个参考指标.

综上所述，在短时受精去除颗粒细胞判断受精与否时，在确保能够正确判断受精的前提下尽可能减少脱颗粒细胞的卵母细胞数量。在新鲜移植过程中优先选择移植短时受精3h 并保留颗粒细胞并在20h 去除颗粒细胞发育来胚胎，这有助于提高胚胎的着床率和临床妊娠率，改善妊娠结局。