自身免疫性前列腺炎大鼠阴茎勃起功能变化的实验研究*

龚 旻 伊庆同 朱汝健 张裕庆 刘 东

上海市浦东医院，复旦大学附属浦东医院泌尿外科（上海 201399）

慢性前列腺炎/慢性骨盆疼痛综合征（chronic prostatitis/chronic pelvic pain syndromes，CP/CPPS） 和勃起功能障碍（erectile dysfunction，ED）均是成年男子的常见病和多发病，严重困扰患者身心健康并影响生活质量[1,2]。国际上CP/CPPS 的临床症状评估采用UPOINT表型分类系统，有学者建议将性功能障碍（主要是阴茎勃起功能障碍）做为第7 个症状，组成UPOINTS 系统[3]。很多流行病学研究证实CP/CPPS 与ED 密切相关[4-6]。CP/CPPS 是否可以导致ED 及其具体作用机制尚未阐明。实验性自身免疫性前列腺炎（experimental autoimmune prostatitis,EAP） 大鼠模型是研究CP/CPPS 最常用的模型[7]。EAP 大鼠可以引起前列腺特异性自身免疫反应，导致炎症细胞浸润前列腺组织，与临床CP/CPPS疾病发展过程相似[8,9]。我们通过构建大鼠EAP 模型，探讨EAP 大鼠的阴茎勃起功能情况，以期进一步阐明EAP 导致ED 可能的发生机制。

材 料

一、实验动物与分组

SPF 级雄性SD 大鼠30 只[购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，合格证编号：20130016005371，动物实验伦理批号：（2017）伦理审字（QWJWXKJS-15）号]，体重120g-140g。饲养条件：室温22 ℃，湿度50%-60%，12h 明暗交替。适应性饲养一周后，利用随机数字表将大鼠随机分为两组：实验组和对照组各10 只。另10 只大鼠用于制备前列腺组织蛋白提纯液。

二、主要试剂

完全弗氏佐剂（F5881）购自Sigma 公司，无细胞百白破联合疫苗（批号201712082-1）购自武汉生物制品研究所有限责任公司，TNF-α ELISA 试剂盒购自美国ThermoScientific 公司，IL-1βELISA 试剂盒(EK301B2/2)购自杭州联科生物技术股份有限公司，Fas（ab82419）及FasL （ab15285） 抗体购自Abcam 公司，β-actin 抗体（GB11001）、masson 染液套装（G1006）购自武汉赛维尔生物科技有限公司，丙二醛测试盒（A003-1）及总超氧化物歧化酶测试盒（A001-1）购自南京建成生物工程研究所，TUNEL 试剂盒（11684817910）购自Roche 公司。

方 法

一、前列腺组织蛋白提纯液制备及EAP 大鼠模型建立

参照叶伟成等人的方法[10]，采用免疫佐剂法制作大鼠EAP 模型。制备前列腺组织蛋白提纯液：取10 只大鼠，3%戊巴比妥钠腹腔内麻醉，进入腹腔，在无菌条件下取出大鼠前列腺组织。用冰生理盐水浸洗，剔除脂肪组织，剪碎前列腺组织后放入玻璃匀浆器中匀浆。最后将匀浆液放入离心管中，12000rpm，4℃，离心30min，用吸管吸去上层脂肪组织，再吸取上清液。采用BCA 法测定前列腺匀浆液蛋白浓度，最后稀释成浓度为20mg/ml，分装后放入-80℃冰箱冷冻保存备用。实验组分别于实验第1d、第7d 采用多点皮内注射大鼠前列腺组织蛋白提纯液与完全弗氏佐剂（等比混匀）共1mL：脚掌0.1ml×2 只，腹股沟0.4mL，颈部0.4mL，同时腹腔注射百白破疫苗0.5mL，第21d 腹腔注射大鼠前列腺组织蛋白提纯液0.5mL，对照组在相同的时间和部位注射相同体积的生理盐水。

二、大鼠最大阴茎海绵体压力（Max ICP）及劲动脉压力检测

第35d, 参照Chen[11]及吴子云[12]等人的方法，大鼠腹腔注射麻醉后取下腹正中切口，寻找并分离大鼠盆腔内海绵体神经，沿阴茎根部游离、 切断坐骨海绵体肌，暴露阴茎脚。用磨成倒刺状的头皮针刺入阴茎脚，连接传感器，打开生物医学信号采集系统(PCLAB-UE)，设置好实验采样参数及刺激参数（波宽0.5ms，电压4V，脉冲15 次/s，持续时间50s），双钩电极刺激阴茎海绵体神经，进行ICP 测定。同时分离大鼠劲动脉，穿刺插管测压。平均动脉血压（MAP）=舒张压+1/3 收缩压。

三、标本的采集

第35d 测完Max ICP 及MAP 后，取两组大鼠的前列腺组织及阴茎组织，仔细剪除附着的脂肪组织和筋膜，冷生理盐水冲洗后以滤纸拭干。前列腺组织及一部分阴茎组织用多聚甲醛液固定，逐级乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切片厚度4μm。另一部分阴茎组织放入液氮中冷冻备用。采集大鼠腹主动脉血2ml，离心后取上清，放入-80℃备用。

四、前列腺组织HE 染色及血清中炎症因子TNF-α及IL-1β 水平检测

前列腺组织切片常规脱蜡、 复水，苏木精染色15min—自来水冲洗1min—1%盐酸酒精分化20 秒—自来水冲洗3min—伊红染色5min—自来水冲洗3min。最后脱水、透明、封固，组织切片扫描仪扫描后观察。血清中炎症因子TNF-α 及IL-1β 水平的检测严格按照ELISA 试剂盒说明书进行，每个血样重复三次，取平均值作为最终结果。

五、阴茎组织中超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)水平检测

称适量液氮冻存阴茎组织，用9 倍体积的蒸馏水匀浆研磨，然后将研磨液3000rpm，离心10min，取上清制备成10%的组织匀浆。用BCA 法测阴茎匀浆组织蛋白浓度。然后严格按照试剂盒说明书操作，测定阴茎匀浆组织SOD 活力与MDA 水平。

六、阴茎组织中凋亡因子Fas/FasL 蛋白表达水平

提取阴茎组织总蛋白，BCA 法测定蛋白浓度，取20μg 的蛋白上样，进行8%的聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳后将蛋白电转印至PVDF 膜上。用封闭液（5%脱脂奶粉的TBS-T）室温封闭1 h。用TBS-T 洗膜后分别孵育Fas、FasL 及β-actin 抗体，4 ℃过夜。次日TBS-T 洗膜后，加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG，室温孵育1 h。最后TBS-T 洗膜后ECL 化学发光显影。条带用Alpha 分析软件进行灰度分析。

七、阴茎组织荧光TUNEL

阴茎组织石蜡切片脱蜡至水，然后滴加蛋白酶K工作液覆盖组织，37℃温箱孵育25min；PBS 洗涤3 次，每次5min； 滴加破膜工作液覆盖组织，常温下孵育20min；PBS 洗涤3 次，每次5min； 滴加试剂盒内TdT和dUTP 混合液（1:9），37℃恒温箱孵育2h；PBS 洗涤3次，每次5min；滴加DAPI 染液，避光室温孵育10min；PBS 洗涤3 次，每次5min；用抗荧光淬灭封片剂封片。最后切片于荧光显微镜下观察并采集图像。每个切片随机选取4 个视野，使用IPP 软件计数凋亡细胞数与正常细胞数，最后计算凋亡指数(AI) ，AI＝凋亡细胞数／(凋亡细胞数＋正常细胞数)。

八、阴茎组织Masson 染色

阴茎组织石蜡切片脱蜡至水，然后切片入重铬酸钾浸泡过夜； 切片入铁苏木素3min，盐酸酒精溶液分化；切片入丽春红酸性品红浸染5min；磷钼酸水溶液浸染1min；苯胺蓝染液染3min；切片用1%冰醋酸分化，无水乙醇脱水；最后二甲苯透明，中性树胶封片。显微镜镜检，图像采集分析，使用IPP 软件计算阴茎海绵体平滑肌与胶原面积比值。

统计学分析

结 果

一、阴茎勃起功能评价

对照组与实验组大鼠阴茎Max ICP 分别为(96.56±2.251)mmHg、(62.71±2.126)mmHg，差异有显著统计学意义（P=0.000）。对照组与实验组平均动脉压（MAP）分别为(129.33±2.214)mmHg、(123.85±4.396)mmHg，差异无统计学意义 （P=0.280）。对照组与实验组Max ICP/MAP 比值分别为(0.747±0.013)、(0.514±0.028)，两组差异有显著统计学意义（P=0.000）。

二、前列腺组织HE 染色及血清中TNF-α 及IL-1β水平

HE 染色结果显示实验组前列腺组织不均匀增生，部分基底膜破坏，慢性炎症细胞浸润间质、腺泡及腺泡周围组织；而对照组前列腺上皮结构完整，未见组织水肿及炎细胞浸润（图1）。实验组大鼠血清TNF-α 水平明显高于对照组[(17.75±1.96) pg/ml vs (11.83±1.94)pg/ml]，两组差异有统计学意义(P=0.039)。实验组大鼠血清IL-1β 水平明显高于对照组[(225.8±61.04)pg/mL vs (88.71±18.15) pg/mL]，两组差异有统计学意义（P=0.041）。

三、阴茎组织中SOD 及MDA 水平检测

实验组大鼠阴茎组织中超氧化物歧化酶水平明显低 于 对 照组 [(98.36±3.795) U/mg vs (118.2±3.275)U/mg]，两组差异有统计学意义（P=0.002）。实验组大鼠阴茎组织中丙二醛水平明显高于对照组[(1.381±0.167)nmol/mg vs(0.941±0.096)nmol/mg，两组差异有统计学意义（P=0.037）。

四、 阴茎组织中凋亡因子Fas、FasL 蛋白的表达水平及荧光TUNEL

实验组大鼠阴茎组织中Fas 及FasL 蛋白的表达水平分别为（0.353±0.076）、（0.334±0.028），对照组分别为（0.107±0.013）、（0.201±0.023），两组差异均有统计学意义 （P 值分别为0.019、0.010）（图2）。阴茎组织荧光TUNEL，可见DAPI 染色的细胞核，箭头所示为凋亡细胞核（图3）。定量分析发现实验组、对照组的凋亡指数分别为15.93%、4.74%，两组差异有显著统计学意义(P=0.000)。

五、阴茎海绵体平滑肌与胶原面积比值

阴茎组织Masson 染色中三角形所示为平滑肌组织，箭头所示为胶原（图4）。大鼠阴茎海绵体平滑肌与胶原面积比值分别为8.28%、24.11%，两组差异均有统计学意义(P=0.012)。

图1 前列腺组织HE 染色

图2 阴茎组织中凋亡因子Fas 及FasL 蛋白的表达水平

图3 阴茎组织荧光TUNEL

图4 阴茎组织Masson 染色（×200）

讨 论

CP/CPPS 患者除了排尿异常及疼痛不适症状外，通常还伴有ED[13]，给患者造成极大困扰，严重危害男性身心健康，耗费巨大医疗资源。众多的流行病学调查显示CP/CPPS 是ED 的独立危险因素[5,14]。有临床研究证实单纯治疗慢性前列腺炎可明显改善大多数患者并发的ED 症状[15]。CP/CPPS 患者血管内皮功能障碍和动脉硬化风险更高，这可能是CP/CPPS 增加ED危险因素的重要机制之一[16]。同时，CP/CPPS 患者往往伴有抑郁或焦虑，这些心理问题可能会降低阴茎勃起功能。内分泌和神经系统因素也可能与CP/ CPPS患者ED 发病有关[17]。CP/CPPS 能否导致ED 及其确切的作用机制还存在很多争议。因此，我们构建了大鼠EAP 模型，以模拟临床CP/CPPS，探讨EAP 对阴茎勃起功能的影响。

本研究成功构建了大鼠EAP 模型，HE 染色结果显示实验组前列腺组织不均匀增生，部分基底膜破坏，慢性炎症细胞浸润间质、腺泡及腺泡周围组织；而对照组前列腺上皮结构完整，没有组织水肿及炎细胞浸润。我们通过测定大鼠最大阴茎海绵体压力及平均动脉压的比值（MaxICP/MAP），发现实验组MaxICP/MAP 明显低于对照组，证实了EAP 大鼠可能存在ED。电刺激大鼠的阴茎海绵体神经可有效的模拟其生理性勃起，勃起后的检测到的压力即为ICP，ICP 可客观、 有效地反应大鼠的勃起功能[18]。同时，我们发现实验组大鼠血清中TNF-α 及IL-1β 水平均高于对照组。炎症在ED的病理生理中起到了重要作用，已有研究证实ED 患者血液中的炎症因子水平明显高于正常对照，且与性表现呈负相关[19]。炎症因子的释放导致阴茎海绵体内皮功能受损，最终导致阴茎血管粥样硬化病变，引起ED[20]。

氧化应激方面，我们发现实验组大鼠阴茎组织中SOD 水平低于对照组，而MDA 水平高于对照组。SOD是一种能够催化超氧化物的酶，是一种重要的抗氧化剂，SOD 可清除活性氧，保护生物膜免受自由基的损害。MDA 是膜脂质过氧化最重要的产物之一，可引起细胞毒性反应。实验组SOD 较少而MDA 增多，说明EAP 大鼠阴茎组织氧化应激加剧、 抗氧化能力水平下降，导致MDA 蓄积，最终导致阴茎组织氧化损伤[21]。有研究表明糖尿病大鼠体内氧化应激加剧，引起阴茎组织凋亡增加，导致勃起功能障碍，而使用强效抗氧化剂后，勃起功能改善[22]。凋亡方面，我们发现实验组大鼠阴茎组织中Fas 及FasL 蛋白的表达水平均高于对照组，且阴茎组织荧光TUNEL 证实实验组的细胞凋亡指数（15.93%）明显高于对照组（4.74%）。Fas/FasL 是最重要的凋亡通路之一，FasL 与Fas 结合后可以激活细胞凋亡信号级联反应，形成凋亡复合体，最终导致细胞凋亡[23]。EAP 大鼠Fas/FasL 凋亡通路激活，阴茎组织凋亡过多，影响其功能。

正常阴茎海绵体由结缔组织和平滑肌组成，两者保持一定的比例，是勃起过程中维持有效静脉关闭机制的基础。ED 患者阴茎组织主要病理变化是结缔组织的增加和平滑肌细胞的萎缩及凋亡[24]。有研究表明阴茎长期暴露于氧化应激的状态下，可诱导一系列组织的慢性炎症和纤维化，组织学表现为大鼠阴茎海绵体组织中平滑肌与胶原面积比值下降[25-27]。本研究同样发现大鼠阴茎组织氧化应激加剧，同时实验组大鼠阴茎海绵体平滑肌与胶原面积比值（8.28%）明显低于对照组（24.11%）。阴茎组织纤维化可降低阴茎的韧性与顺应性，最终导致ED。

本研究证实EAP 大鼠存在血清中炎症因子升高、阴茎组织氧化应激加剧、凋亡增加、平滑肌与胶原面积比值下降，阴茎海绵体压力下降。这些因素可能共同导致阴茎组织结构与功能受损，从而可能引起ED。本研究有望为临床治疗CP/CPPS 导致的ED 患者提供新思路及策略。本研究是一项初步动物研究，尚不能完全反映CP/CPPS 伴发ED 患者的病理生理、 性功能及心理状态变化，需要进一步的研究证据来明确CP/CPPS 和ED 之间的关系。