贝伐单抗结合紫杉醇对肺癌小鼠的治疗效果及对癌组织S100A4和MMP-9的影响

毛卫波，朱忆凌，严礼平，周佳慧，黄渊，陈国荣

（1.温州医科大学附属第五医院 丽水市中心医院 病理科，浙江 丽水 323000；2.温州医科大学附属第一医院 病理科，浙江 温州 325015）

大部分肺癌患者在诊断时已属于中晚期，1年生存率极低，且发病率逐年上升[1]。目前临床上治疗肺癌的方式主要为化疗、放疗和手术治疗，但化疗放疗的不良反应较为严重，手术治疗也只适用于肺癌早期患者，因此筛选出不良反应小，抗癌效应强的药物是当前研究的重点。紫杉醇可从短叶紫衫树皮中提取，对Leweis肺癌细胞的生长有显著的抑制作用[2]。有研究表明，紫杉醇抗血管生成能力较强，能显著抑制肿瘤细胞血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表达，进而间接抑制肿瘤细胞血管的形成[3]。但紫杉醇本身具有一定的细胞毒性，因此，寻找能提高紫杉醇疗效的抗肿瘤药物是当前治疗肺癌的重要方向。贝伐单抗作为一种重组的人源化单克隆抗体，也能与VEGF结合并阻断其生物活性，从而有效地抑制肿瘤血管生成[4-5]，本研究拟分析两者结合应用的抗肿瘤效果是否能优于单味药。S100钙结合蛋白A4（S100 calcium binding protein A4，S100A4）和基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-9蛋白都参与了肿瘤细胞远处侵袭转移的过程，它们表达水平的变化对于监测肿瘤的发展具有指导意义。本研究通过对肿瘤细胞VEGF和相关蛋白表达的变化来阐述贝伐单抗结合紫杉醇的抗癌效果。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 细胞：鼠源性Leweis肺癌瘤株，由国家实验细胞资源共享平台提供。

1.1.2 实验动物：50只SPF级健康C57BL/6小鼠，6～8周龄，体质量20～25 g，由温州医科大学实验动物中心提供，动物许可证：SCXK（浙）2016-0010。

1.1.3 药品与主要试剂：紫杉醇，规格：30 mg/支，国药准字H20053837（合肥大东方药业有限责任公司）；贝伐单抗，规格：100 mg/支，批号：B6003B02（上海罗氏制药有限公司）；IL-2、IL-6、TNF-α和VEGF的ELISA试剂盒，均购自南京建成生物有限公司；S100A4和MMP-9的ELISA试剂盒购于武汉博士德生物工程有限公司；S100A4和MMP-9试剂盒购于上海森雄科技实业有限公司。

1.1.4 主要仪器：7600全自动生化分析仪（日本日立公司）、3K15超低温离心机（德国Sigma公司）、酶标仪（美国博腾仪器公司）、 CytoFLEX流式细胞仪（美国贝克曼库尔特公司）

1.2 方法

1.2.1 C57BL/6小鼠肺癌造模：将Leweis肺癌细胞在37 ℃下快速解冻，复苏后的细胞采用含10%胎牛血清的培养基培养，培养至正常状态下，取对数生长期的癌细胞接种于小鼠右腋下，21 d后，对状态较好的小鼠脱颈椎处死，取出生长完整的瘤组织，将其包膜剔除，制成癌细胞悬液后，分别取0.2 mL接种于小鼠右腋下（细胞数目：2×106/只）。

1.2.2 实验分组与给药方法：将实验小鼠分为正常组（未接种瘤液）、模型组（接种瘤液）、贝伐单抗组（接种瘤液）、紫杉醇组（接种瘤液）、联合组（接种瘤液），每组8只。正常组和模型组腹腔注射0.9%氯化钠溶液0.4 mL/只，每周2次；贝伐单抗组腹腔注射15 mg/kg贝伐单抗，每周2次；紫杉醇组腹腔注射10 mg/kg紫杉醇，每周2次；联合组分别腹腔注射15 mg/kg贝伐单抗和10 mg/kg紫杉醇，每周2次。所有小鼠给药2周。

1.2.3 瘤重与抑瘤率：给药2周后，处死小鼠，取出肿瘤组织称重，计算抑瘤率。抑瘤率（%）=（对照组平均瘤重-实验组平均瘤重）/对照组平均瘤重× 100%。

1.2.4 ELISA法测定IL-2、IL-6及TNF-α的含量：给药2周后，小鼠摘眼球取血2～3 mL，静置2～3 h后，以3 000 r/min离心10 min，取血清。ELISA试剂盒检测血清中IL-2、IL-6及TNF-α的含量。

1.2.5 采用流式细胞技术检测T淋巴细胞亚群：同上得血清，采用流式细胞仪检测血清中CD3+、CD4+、CD8+的比例，并计算CD4/CD8比值。

1.2.6 ELISA法和Western blot法测定VEGF含量及蛋白表达水平：同上得血清，按照ELISA试剂盒说明书操作检测血清中VEGF含量。取出的肿瘤组织，定量称取做组织匀浆，用Western blot法检测其中VEGF表达水平。

1.2.7 ELISA法测定肿瘤组织中S100A4与MMP-9表达水平：同上的组织匀浆，按照ELISA试剂盒说明书操作检测组织中S100A4与MMP-9含量。

1.3 统计学处理方法 采用软件SPSS20.0进行统计学分析。计量资料用（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间比较采用LSD-t检验。P＜ 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 贝伐单抗结合紫杉醇对肺癌小鼠瘤重以及抑瘤率的影响 连续给药2周后，贝伐单抗组、紫杉醇组以及联合组的瘤重显著低于模型组（P＜0.05），且紫杉醇组、联合组的瘤重显著低于贝伐单抗组（P＜0.05）；联合组抑瘤率明显高于贝伐单抗组和紫杉醇组（P＜0.05），紫杉醇组抑瘤率明显高于贝伐单抗组（P＜0.05）。见表1。

表1 5组小鼠瘤重、抑瘤率的比较（每组n=8， ）

表1 5组小鼠瘤重、抑瘤率的比较（每组n=8， ）

与模型组比：aP＜0.05；与贝伐单抗组比：bP＜0.05；与紫杉醇组比：cP＜0.05

组别 瘤重（g） 抑瘤率（%）正常组 - -模型组 7.48±0.66 -贝伐单抗组 4.12±0.86a47.25±4.54紫杉醇组 3.13±0.34ab73.02±6.98b联合组 0.99±0.28abc88.12±9.08bcF12.343 243.432P＜0.001 ＜0.001

2.2 贝伐单抗结合紫杉醇对肺癌小鼠血清中IL-2、IL-6及TNF-α含量的影响 模型组、贝伐单抗组、紫杉醇组、联合组小鼠血清中的IL-2、IL-6及TNF-α含量与正常组比较升高（P＜0.05）；贝伐单抗组、紫杉醇组以及联合组的上述指标含量显著低于模型组（P＜0.05）；同时紫杉醇组以及联合组的上述指标含量明显低于贝伐单抗组（P＜0.05）；紫杉醇组血清IL-2和IL-6含量明显高于联合组（P＜0.05），而紫杉醇组血清TNF-α含量明显低于联合组（P＜0.05），见表2。

表2 5组小鼠IL-2、IL-6及TNF-α含量的比较（每组n=8， ，pg/mL）

表2 5组小鼠IL-2、IL-6及TNF-α含量的比较（每组n=8， ，pg/mL）

与正常组比：aP＜0.05；与模型组比：bP＜0.05；与贝伐单抗组比：cP＜0.05；与紫杉醇组比：dP＜0.05

组别 IL-2 IL-6 TNF-α正常组 110.43±11.21 33.02±4.89 98.02± 4.89模型组 265.48±14.66a75.06±6.88a300.06±26.88a贝伐单抗组 206.12±12.86ab51.25±5.54ab262.25±20.54ab紫杉醇组 198.13±12.34abc45.02±3.98abc117.02±20.98abc联合组 120.99±13.28abcd37.12±4.08abcd152.12±26.08abcdF132.234 104.561 201.232P＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

2.3 贝伐单抗结合紫杉醇对肺癌小鼠T淋巴细胞亚群的影响 模型组、贝伐单抗组、紫杉醇组、联合组小鼠血清中的CD3+、CD4+、CD8+、CD4/CD8的水平与正常组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；贝伐单抗组、紫杉醇组以及联合组的上述指标含量与模型组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；紫杉醇组及联合组的上述指标含量与贝伐单抗组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；紫杉醇组与联合组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

2.4 贝伐单抗结合紫杉醇对肺癌小鼠VEGF含量及蛋白表达水平的影响 模型组、贝伐单抗组、紫杉醇组、联合组小鼠血清VEGF含量以及癌组织VEGF蛋白表达水平与正常组比升高（P＜0.05）；给药2周后，贝伐单抗组、紫杉醇组以及联合组的上述指标与模型组降低（P＜0.05）；紫杉醇组及联合组的上述指标与贝伐单抗组比差异有统计学意义（P＜0.05）；紫杉醇组与联合组比差异有统计学意义（P＜0.05），见表4。

表3 5组小鼠CD3+、CD4+、CD8+、CD4/CD8水平的比较（每组n=8， ）

表3 5组小鼠CD3+、CD4+、CD8+、CD4/CD8水平的比较（每组n=8， ）

与正常组比：aP＜0.05；与模型组比：bP＜0.05；与贝伐单抗组比：cP＜0.05；与紫杉醇组比：dP＜0.05

组别 CD3+（%） CD4+（%） CD8+（%） CD4/CD8正常组 66.43±6.21 42.02±4.89 23.02±3.89 1.72±0.29模型组 38.48±4.66a25.06±3.88a32.06±3.88a0.86±0.18a贝伐单抗组 50.12±3.86ab34.25±4.54ab25.25±3.54ab1.25±0.34ab紫杉醇组 21.13±3.34abc20.02±3.98abc38.02±3.98abc0.52±0.18abc联合组 43.99±3.28abcd30.12±3.08abcd28.12±4.08abcd1.02±0.08abcdF33.234 45.432 234.453 23.222P＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

表4 5组小鼠VEGF含量和蛋白相对表达水平比较（每组n=8，）

表4 5组小鼠VEGF含量和蛋白相对表达水平比较（每组n=8，）

与正常组比：aP＜0.05；与模型组比：bP＜0.05；与贝伐单抗组比：cP＜0.05；与紫杉醇组比：dP＜0.05

组别 含量（pg/mL） 蛋白相对表达水平正常组 10.43±1.21 0.35±0.11模型组 33.48±4.66a0.97±0.16a贝伐单抗组 23.12±2.86ab0.60±0.16ab紫杉醇组 28.13±3.34abc0.71±0.14abc联合组 20.99±2.28abcd0.44±0.11abcdF342.123 123.342P＜0.001 ＜0.001

2.5 贝伐单抗结合紫杉醇对肺癌小鼠S100A4与MMP-9含量的影响 模型组、贝伐单抗组、紫杉醇组、联合组小鼠癌组织中S100A4与MMP-9含量显著高 于正常组（P＜0.05）；与模型组比较，贝伐单抗组、紫杉醇组、联合组小鼠癌组织中S100A4、MMP-9的含量显著降低（P＜0.05）；紫杉醇组及联合组S100A4、 MMP-9含量较贝伐单抗组降低（P＜0.05）；与紫杉醇组比较，联合组小鼠癌组织中S100A4与MMP-9含量显著减少（P＜0.05）。见表5。

表5 5组小鼠S100A4、与MMP-9含量比较（每组n=8， ，pg/mL）

表5 5组小鼠S100A4、与MMP-9含量比较（每组n=8， ，pg/mL）

与正常组比：aP＜0.05；与模型组比：bP＜0.05；与贝伐单抗组比：cP＜0.05；与紫杉醇组比：dP＜0.05

组别 S100A4 MMP-9正常组 926.02±105.78 17.02±1.89模型组 2 836.06±199.34a47.06±6.88a贝伐单抗组 2 288.25±421.83ab40.25±8.54ab紫杉醇组 1 933.02± 3.98abc37.02±4.98abc联合组 1 508.12±116.90abcd32.12±6.08abcdF336.339 112.398P＜0.001 ＜0.001

3 讨论

抗肿瘤药物的联合使用是当前最主要的肿瘤治疗方式。化疗是目前临床治疗肺癌的主要治疗手段，充分了解化疗药物的药理机制对临床合理应用具有重要参考价值。目前贝伐单抗联合紫杉醇是临床上治疗非鳞非小细胞肺癌的常用方案。本研究结果显示，贝伐单抗联合紫杉醇能显著降低小鼠的瘤重，提高抑瘤率。贝伐单抗能特异性地结合VEGF，影响肿瘤血管的形成，从而抑制癌细胞的生长，同时紫杉醇的作用靶点在微管蛋白，其能抑制微管的有丝分裂从而使癌细胞凋亡坏死。两者在抗肿瘤的形成与发展中起协同作用。

IL-2和IL-6是在炎症反应中起重要的细胞因子，其能促进T细胞的增殖，诱导多种杀伤细胞的分化，还能诱导TNF-α、IFN-λ等炎症反应因子的产生，从而诱导肿瘤细胞的增殖，研究证明贝伐单抗能显著降低肿瘤小鼠体内炎性因子的水平，改善小鼠免疫能力[6-7]。而过量的TNF-α与受体结合后能激活细胞核因子以及调控细胞间信息的激酶，促进肿瘤细胞的转移与侵袭。有研究证明，抑制TNF-α表达，能够改善机体的代谢，抑制肿瘤的复发与转移[8]。本研究也验证了贝伐单抗结合紫杉醇能显著降低肺癌小鼠TNF-α、IL-2和IL-6水平，同时改善小鼠细胞免疫能力（CD3+、CD4+、CD8+、CD4/CD8）。进一步说明两种药物的联合使用能更有效地抑制肿瘤细胞的增殖扩散，减轻小鼠体内肿瘤的负荷，一定程度上提高了细胞因子的分泌水平，促进了免疫功能的恢复。同时肿瘤的形成及生长需要新生血管来为其提供生存所需的氧气和营养物质[9-11]。VEGF能够增加血管渗透性导致蛋白沉积，从而促进了血管的生成。有研究报道肿瘤血管的抑制会造成肿瘤细胞的凋亡坏死，并证明紫杉醇的抗肿瘤作用与其能抑制血管生成有关[12]。贝伐单抗作为一种重组的人源化单克隆抗体，也能与VEGF结合并阻断其生物活性，从而使肿瘤血管形成受到阻碍，导致肿瘤组织萎缩。本研究结果表明，贝伐单抗组和紫杉醇组均能显著降低肺癌小鼠血清中VEGF的含量，但联合组的效果最好。其原因分析主要是贝伐单抗作为血管生成抑制剂，能够诱导肿瘤血管的结构、功能发生改变，使其失去肿瘤血管的病理特征，并趋向于正常化，从而改善了肿瘤微环境，同时联合紫杉醇，能够增加渗透到肿瘤内的药物量，提高化疗的效果。

MMP-9是锌金属蛋白酶超家族重要的一员，属于明胶酶，能够降解细胞外基质。研究证明[13]，MMP-9通过分解正常细胞外基质和基底膜，使癌细胞能够进入血液，参与循环，进一步导致肿瘤细胞转移。MMP-9也参与肿瘤血管形成，增强肿瘤细胞远处侵袭转移的能力[14]。S100A4是重要的功能蛋白，它主要介导了细胞信号传导、细胞外基质分泌和细胞的增殖分化。有研究表明S100A4参与肿瘤细胞远处侵袭转移过程[15-16]。本研究结果显示，模型组小鼠癌组织中的S100A4与MMP-9的含量明显高于贝伐单抗组和紫杉醇组，同时还发现相比于紫杉醇组和贝伐单抗组，联合组更能显著降低C57BL/6小鼠肺癌组织中S100A4与MMP-9含量。由于在抗肿瘤治疗过程中，单一的给药治疗容易出现耐药现象，而贝伐单抗与紫杉醇具有协同效应，能进一步增加了抗肿瘤的效果。巨噬细胞释放大量的MMP-9蛋白，以及S100A4蛋白的过量表达能够增强肿瘤细胞的侵袭，而贝伐单抗结合紫杉醇能增强紫杉醇对癌细胞的杀伤力，提高机体的免疫能力，从而降低MMP-9以及S100A4蛋白的表达。

综上所述，贝伐单抗结合紫杉醇治疗能够增强抗肿瘤的效果，降低肿瘤小鼠血清中VEGF的含量以及肺癌组织中S100A4与MMP-9含量，但其对抗肿瘤细胞的分子机制的作用、抗癌基因的作用还需要进一步阐明。