胃肠道间质瘤组织中Gli-1、p-AKT、p-ERK的表达及意义

祁义军 赵文娣 王正林 杨书瀚 汪正广

转录因子Gli（Glioma-associated Oncogene homoglog）是Shh通路的重要组成部分，也是Shh信号通路的靶基因[1]。阻断肿瘤细胞中的Shh信号转导通路某个节点，有可能为肿瘤的靶向治疗提供一个新的途径[2]。前期的研究[3]我们发现GIST中有Shh信号通路的存在，且与GIST的发生发展密切相关，但具体机制不清。PI3K信号通路和MAPK信号通路是目前已被证明与GIST关系密切的信号通路[4]，为探讨Shh信号通路在GIST中是否与PI3K和MAPK信号通路有关联，我们用Western方法检测了我院一年间手术的GIST患者标本，并分析其相互间的关系。

1 资料与方法

1.1 标本与试剂

1.1.1 标本 145例标本选自2013年1月-12月安徽医科大学第一附属医院行手术治疗的GIST患者，临床资料完整。术前均未接受其他治疗（如化疗或放疗）。标本处理：中性福尔马林（10%）固定后常规石蜡包埋，连续切片（4μm），HE染色。病理诊断由两位病理医师阅片共同诊断核实。

1.1.2 试剂 主要试剂来源：Anti-Tubulin Ab购自Sigma，p-AKT Ab 、p-ERK1/2 Ab购自Cell Signaling，Anti-AKT Ab和Anti-ERK1/2 Ab购自BioWorld，Anti-Gli-1Ab购自Santa Cruz。

1.2 方法

1.2.1 石蜡组织提取蛋白 ①取厚约10～15 um的石蜡切片两块，取100 mm2石蜡组织切片放入离心管，加入预处理试剂A1 mL，30 s高速涡悬震荡后再5 min室温静置；加入100 uL预处理试剂B，涡悬震荡（10 s）后离心。②脱蜡组织清洗两次后保留的组织块予以沉淀；加入提取试剂100 uL，震荡后予20 min 100 ℃加热，离心后切片组织用组织研磨棒磨碎。③2 h 60 ℃加热后离心15 min（4 ℃，12000 rpm)，加入沉淀试剂1 mL，震荡后4 ℃静置10 min；15 min离心(4 ℃，12000 rpm)，去上清液留沉淀。④加入沉淀试剂0.5 mL加入后10 s震荡，静置10 min 4 ℃后离心15 min（4 ℃，12000 rpm）。⑤仅保留沉淀，离心管倒置滤纸上（通风橱中），使残余液体挥发完全；组织裂解液溶解固体沉淀，15 min沸水浴，10 min离心（4 ℃，12000 rpm），收集上清液后上样分析。

1.2.2 免疫印迹 ①垂直电泳：采用SDS-PAGE凝胶垂直电泳，同时使用蛋白质预染Marker，电压设定：浓缩胶电泳电压恒压80 V；分离胶电泳电压恒压120 V。②转膜：取厚滤纸两张，PVDF膜一张，大小90 mm×70 mm，PVDF膜在甲醇中润湿后，再同滤纸一起浸透于转移缓冲液。放置于转膜夹上的顺序（由上而下）为海绵、滤纸、PVDF膜、凝胶、滤纸、海绵。转膜时电压：恒流220 mA，时间1.5～2 h。③封闭：待转膜完成后取出PVDF膜，置10 mL含有5%BSA的1×TBST封闭液，将其在60 rpm/min的水平摇床上封闭1 h（室温）。④一抗：5%BSA的1×TBST配制非标记抗体，PVDF膜（封闭后的）放入一抗中，1 h室温孵育后洗膜3次。⑤二抗：HRP酶标二抗用含5%BSA的1×TBST配制，放入二抗后1 h室温孵育，洗膜3次。⑥显影：PVDF膜上均匀涂布MilliPore显影液（A液与B液按1:1混匀），吸干显色液（反应1 min后），X光片曝光，显影用显影液及定影液，显影好的X光片晾干。

1.3 统计学方法 统计学处理采用SPSS（16.0 for window）软件，根据资料性质分别采用卡方检验各蛋白表达与临床参数间关系，P＜0.05为差异有统计学意义；Pearson分析各蛋白表达相关性。

2 结 果

2.1 临床病例资料 145例GIST患者中，男80例（55.2%），女65例（44.8%），年龄18～84岁，平均年龄（60.52±11.42）岁，中位年龄62岁。其中胃间质瘤84例（57.9%），小肠间质瘤32例（22.1%），结直肠间质瘤6例（4.1%），食管间质瘤2例（1.4%），胃肠外间质瘤21例（14.5%）。①肿瘤大小：最大直径≤2.0 cm者35例（24.1%），2.1～5.0 cm者48例（33.1%），5.1～10.0 cm者37例（25.5%），＞10.1 cm者25例（17.2%）。②NIH危险度分级：极低危险度26例（17.9%）；低度危险度41例（28.3%）；中度危险度30例（20.7%）；高度危险度48例（33.1%）。见表1。

2.2 Western-blot检测不同危险程度GIST中Gli1、p-AKT和p-ERK的表达 如图1所示：Western blot检 测 不 同 危 险 程 度GIST中Gli-1、p-AKT、p-ERK的表达，GelDoc测量Gli-1与Tubulin、p-AKT与AKT、p-ERK与ERK的灰度相对比值，结果显示：在不同危险程度GIST组织中，其Gli-1与 Tubulin、p-AKT与AKT、p-ERK与ERK的灰度相对比值与危险程度分级呈正相关，随着危险等级的升高，Gli-1、p-AKT、p-ERK的表达也上升，且升高具有一致性（相关系数0＜r＜1，P＜0.01）。

图1 Western Blot检测不同危险程度GIST中Gli-1、p-AKT、p-ERK的表达

3 讨 论

脊椎动物中，Shh信号通路包括了Hh配体、Patched（Ptch）受体、G蛋白偶联的磷酸化受体（Smo）、核转录因子Gli四个部分。Zhao C等[5]研究发现抑制Shh信号通路时，可降低野生型BCR-ABL1的慢性粒细胞白血病（CML)的传播，且可降低伊马替尼耐药的CML肿瘤细胞的生长。伊马替尼也是治疗GIST的一线药物，因而Shh信号通路是否在伊马替尼耐药的GIST治疗中起作用引起研究者的兴趣。我们前期研究[4]已经发现GIST中有Shh信号通路的存在，且与GIST的发生发展密切相关，但具体机制不清。

PI3K主要由催化亚单位P110和调节亚单位P85构成。细胞膜上的相应受体接受细胞外信号刺激后使PI3K活化，生成的PI-3，4，5-P3即作为第二信使，进一步通过磷酸化而活化其下游的Akt蛋白。PI3K/Akt信号能促进肿瘤坏死因子（TNF）诱导的内皮细胞迁移，调节肿瘤血管生成进而促进肿瘤生长和转移。本实验发现，PI3K/Akt信号通路在GIST中有表达，且随着GIST危险度分级的升高，PI3K/Akt表达逐渐上调，表明PI3K/Akt信号通路参与了GIST的发生发展过程。

目前发现MAPK信号通路共有8个亚家族，最早被发现和目前了解最多的是成员亚族ERK。ERK1/2作为重要传递者将信号从细胞膜外传递到细胞内，ERK1/2活化以后可以进入细胞核，促进重要转录因子的磷酸化，进而参与细胞的增殖、分化和凋亡等。我们的研究虽发现MAPK信号通路在GIST的发生发展中起作用，但是其具体作用机制目前报道仍较少。本组资料中，MAPK信号通路中ERK在所有不同危险度组均有不同程度的表达，表明ERK可能参与了GIST的发生、发展过程。王春萌等[6]报道MAPK通道蛋白在GIST中均有阳性表达，其表达在GIST耐药标本及药物敏感标本间无区别（该组资料对8例GIST患者进行检测），因此仍需多中心大样本的研究。

细胞信号传导通路是一个复杂的网络系统，不同的信号通路间可有交叉调控。本研究发现GIST中PI3K/Akt信号通路、MAPK/ERK信号通路和Shh信号通路均有表达，表明上述三条信号通路均参与了GIST的发生发展过程。其表达的强度密切相关，具有高度一致性，表明上述三条通路在GIST中可能具有交叉联系。由此推测：Shh信号通路在GIST的发生发展中起作用，通过与业已被证明在其中起重要作用的PI3K/Akt信号通路和MAPK/ERK信号通路之间的交叉联系可能是其机制之一。此发现将为寻找治疗GIST 的新靶点提供理论依据。