粟酒裂殖酵母Cyc2定位及功能的研究

杨贵红,黄 鹰

(南京师范大学生命科学学院,江苏 南京 210023)

线粒体是细胞呼吸的主要场所,其主要作用是通过氧化磷酸化产生细胞活动所需的能量[1],被称为细胞的“动力车间”. 此外,线粒体还参与细胞氧化还原、信号转导以及细胞凋亡等生命活动[2-4],因此深入研究线粒体各种特性对生命科学具有重要意义.

细胞色素c(Cyt c)是一种水溶性含铁血红素蛋白[5],它可以通过改变铁离子的价态在呼吸链复合体之间传递电子,因此它是线粒体呼吸链的必要成分[5-6]. 人们发现,在真菌、绿藻和动物的线粒体中可以利用细胞色素c血红素裂解酶(CCHL)将血红素连接到脱辅基细胞色素c的半胱氨酸上,以完成细胞色素c的装配[4-6]. 脱辅基细胞色素巯基和血红素的还原状态对于细胞色素c的装配至关重要[6],控制血红素与脱辅基细胞色素c连接的氧化还原因素在细菌和质体中是已知的[1,5-6],而在芽殖酵母中,CYC2被认为是细胞色素c的装配因子,在c型细胞色素的成熟中具有氧化还原功能,在细胞色素c的组装过程中发挥重要作用,对线粒体功能的发挥具有重要意义[7-11].

芽殖酵母的CYC2含有一个FAD结构域,定位于线粒体内膜[7],敲除该基因会使得脱辅基细胞色素c的线粒体输入部分缺失从而使细胞色素c的表达水平降低约20%,导致线粒体功能缺陷[8-9,11-12]. 通过同源比对发现裂殖酵母Cyc2与芽殖酵母的CYC2相似性达到26.78%,目前为止,还尚未有关于Cyc2的研究. 因此本文旨在揭示粟酒裂殖酵母中Cyc2的定位及相关功能,为线粒体蛋白功能的研究提供一定的理论依据.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种与质粒

实验所用菌种：粟酒裂殖酵母单倍体菌yHL6381、大肠杆菌DH5α;所用质粒:pFA6a-hphMX、pJK148-myc-hphMX和pYJ19.

1.1.2 培养基

YES培养基(100 mL):酵母粉0.5 g,葡萄糖3 g,腺嘌呤、组氨酸、尿嘧啶、亮氨酸为22.5 mg;YES+6%、3%甘油: 培养基的碳源为不同浓度的甘油.

1.2 方法

1.2.1 生物信息学分析

蛋白序列比对分析使用AlignX;利用在线预测网站(http://ihg.gsf.de/ihg/mitoprot.html)分析蛋白是否有线粒体定位序列;利用在线预测网站(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)分析蛋白是否有跨膜结构域.

1.2.2 菌种构建

扩增得到cyc2的上、下游同源臂后,将其构建到pFa6a-hphMX质粒上,然后将cyc2(up)-hph-cyc2(dw)片段转化到yHL6381菌株内得到Δcyc2菌株;扩增cyc2基因片段,构建到pYJ19质粒上,使用NruI限制酶切割重组质粒得到线性片段并转入菌株Δcyc2中,得到Cyc2-GFP菌株. 将cyc2基因片段构建到质粒pJK148-myc-hphMX上得到重组质粒pJK148-cyc2-myc-hphMX,使用NruI限制酶分别切割pJK148-myc-hphMX和pJK148-cyc2-myc-hphMX得到线性片段并转入Δcyc2中,得到空载回补菌株pJK148和全长回补菌株cyc2;将cyc2-myc-hph片段转入Tom20-Flag菌株中得到菌株Tom20-Flag/Cyc2-Myc.

1.2.3 表型实验

实验前3 d在YES固体培养基上将菌种划线活化. 将菌种接种至YES培养基内,初始OD600 调至0.2左右,32 ℃培养12 h. 将菌液OD600 均调至3左右,按10倍梯度依次进行稀释. 取3 μL菌液在固体培养基上点圈,32 ℃倒置培养.

1.2.4 Western blot检测线粒体蛋白表达量

分别提取菌株Δcyc2和yHL6381的线粒体,取等量的线粒体进行处理得到所需的蛋白样品后进行Western blot检测.

1.2.5 荧光显微镜观察Cyc2定位

将Cyc2-GFP菌株在固体培养基上进行划线活化后. 将菌株接种于液体培养基内,培养12 h后转接至新鲜培养基并调整OD600=0.2后继续培养,大约培养4 h后,菌液OD600约为0.6,收菌,用PBS缓冲液洗一次后,向菌体内加入Mitotracker染料进行染色,时间为2.5 min,然后使用荧光显微镜进行观察.

1.2.6 线粒体定位实验

选取细胞核蛋白Sla1和线粒体基质蛋白Hsp60为对照,通过Western blot检测菌株Tom20-Flag/Cyc2-Myc的线粒体蛋白样品以确定Cyc2是否定位于线粒体;以线粒体外膜蛋白Tom20和Hsp60为对照,分别用TritonX-100和Proteinase K处理菌株Tom20-Flag/Cyc2-Myc的线粒体,以检测Cyc2是否定位于线粒体外膜;使用碱性碳酸钠处理Tom20-Flag/Cyc2-Myc的线粒体,以线粒体内膜蛋白Cox1和Hsp60为对照,碳酸钠破坏线粒体膜,通过高速离心使位于基质和膜间隙的蛋白分布于上清中,而线粒体膜蛋白则会留在沉淀内,以检测Cyc2是否为膜结合蛋白.

2 结果与讨论

2.1 粟酒裂殖酵母Cyc2生物信息学分析结果

通过在GeneDB和NCBI数据库的搜索,得到裂殖酵母cyc2基因序列,其系统名为SPAC17H9.12c. 该蛋白由266个氨基酸残基组成,预测的分子量约为29.37 kD. 通过序列比对可知芽殖酵母的CYC2和裂殖酵母的Cyc2相似性达26.78%,比对结果如图1.

2.2 Δcyc2菌株的表型研究

2.2.1 菌种的构建

(1)Δcyc2的构建和验证

cyc2上、下游同源臂扩增结果如图2A所示;转化子的酶切验证结果如图2B,C所示. 将含有同源臂及潮霉素基因的片段导入yHL6381内,选取几个转化子进行验证,在上游同源臂的上游设计引物记为P1,在潮霉素基因上设计一对引物记为P2和P3,在下游同源臂的下游设计一个引物记为P4,使用P1+P2进行PCR,结果如图2D所示,使用P3+P4进行PCR,结果如图2E所示,使用P1+P4进行PCR,结果如图2F所示,结果显示菌株构建成功.

(2)全长回补菌株cyc2的构建和验证

PCR得到cyc2基因片段(图2G);重组质粒酶切验证(图2H);得到片段cyc2-myc-hph-LEU(图2I)导入Δcyc2内,挑选正确转化子进行后续实验.

2.2.2 点圈结果

为了探究Cyc2的功能,分别构建了Δcyc2、pJK148及cyc2菌株并在YES和甘油培养基上进行点圈,结果如图3所示. 在甘油培养基上,Δcyc2和pJK148菌株生长减缓,而全基因回补菌株cyc2与野生型生长情况相同. 这说明cyc2基因的敲除会使得菌株的线粒体呼吸功能受损,这与芽殖酵母中的CYC2的表型不一致,暗示该基因在两种酵母中的功能可能不一样.

2.3 Cyc2对线粒体呼吸链蛋白的影响

线粒体的呼吸作用主要依赖于内膜上的呼吸链及氧化磷酸化[1,3,13-16]. 上述实验已经证明Cyc2缺失后会影响线粒体的呼吸功能,为了探究Cyc2在线粒体中是如何行使功能的,分别检测了Δcyc2菌株中由mtDNA编码的呼吸链蛋白Cob1、Cox1、Cox2、Cox3和Atp6的表达量,以Hsp60作为内参. 结果如图4所示,与野生型菌株相比,Δcyc2菌株内线粒体蛋白Cob1、Cox1、Cox2、Cox3和Atp6表达量没有明显变化,这说明Cyc2的缺失不会影响呼吸链蛋白的表达,猜测Cyc2可能通过其他途径影响了线粒体功能.

2.4 Cyc2的定位研究

2.4.1 生物信息学分析

(1)Cyc2线粒体定位序列(MTS)的分析

借助在线工具MitoProt II对Cyc2序列进行分析,Cyc2定位于线粒体的概率为70.68%. 根据预测结果(表1)可知,Cyc2蛋白N端的16aa残基为线粒体信号肽,其中含有5 个碱性残基.

(2)Cyc2跨膜结构域的分析

借助在线预测网站对Cyc2的跨膜结构域进行分析,根据预测结果(表2及图5)可知,Cyc2跨膜结构域个数为0,N端为跨膜序列的可能性为47.911%,跨膜氨基酸个数预测为9.242 8,综合结果可知,Cyc2没有跨膜结构域.

表2 Cyc2跨膜结构域分析结果Table 2 Analysis results of transmembrane domain of Cyc2

表1 Cyc2线粒体定位序列(MTS)分析结果Table 1 Analysis results of mitochondrial localization sequence(MTS)of Cyc2

2.4.2 荧光显微镜观察

通过给Cyc2蛋白加GFP标签来确定蛋白在细胞中的定位,Mitotracker染料可以将线粒体染成红色,而GFP为绿色,若蛋白定位于线粒体,两种颜色会重叠显示为黄色. 结果如图6所示,Cyc2定位于线粒体.

2.4.3 提取线粒体确定蛋白在细胞中的定位

荧光实验已经证明Cyc2定位于线粒体,为了进一步验证这一结果,实验提取了菌株Tom20-Flag/Cyc2-Myc的线粒体,并保留全蛋白样品T、线粒体蛋白样品Mt以及除线粒体外其他组分蛋白PMS,选择Sla1和Hsp60作为对照,结果如图7所示,Cyc2确实定位于线粒体.

2.4.4 TritonX-100和蛋白酶K处理

已知Cyc2定位在线粒体,那么它具体定位于线粒体的哪一部分呢?为了进一步确定Cyc2的定位,以Tom20和Hsp60为对照. 使用TritonX-100和Proteinase K处理菌株Tom20-Flag/Cyc2-Myc的线粒体,结果如图8所示,Cyc2不是线粒体外膜蛋白,可能为线粒体基质蛋白或者线粒体内膜蛋白.

2.4.5 碱性碳酸钠处理线粒体

上述实验证明Cyc2定位于线粒体基质或内膜,为进一步确定其定位,使用NaCO3处理菌株Tom20-Flag/Cyc2-Myc的线粒体后高速离心,以Cox2和Hsp60作为对照. 结果显示(图9),Cyc2主要分布在沉淀P组分中,上清S组分中只有少量,与内膜蛋白Cox2相似. 因此Cyc2与线粒体内膜结合,结合跨膜结构预测结果可以确定Cyc2为线粒体内膜的外在膜蛋白.

3 结论

酵母作为一种模式生物参与基础生物学研究已经有两百多年的历史. 其中以酿酒酵母和粟酒裂殖酵母研究最多. 粟酒裂殖酵母的全基因组测序工作已经完成,它含有4 284个可以编码蛋白质的基因,培养简单快速,在研究基因功能方面具有很大的优势. 同时从进化角度来看,粟酒裂殖酵母与人的亲缘关系较亲近,所以研究粟酒裂殖酵母的蛋白功能对于人类的发展具有重要意义.

芽殖酵母的CYC2蛋白在细胞色素c的组装过程中发挥重要作用,缺失后会影响细胞色素c的成熟[6,12],从而影响呼吸链电子的传递,使线粒体无法正常发挥功能. 通过序列比对发现粟酒裂殖酵母中的Cyc2蛋白与芽殖酵母的CYC2蛋白相似性达26.78%,且都具有FAD结构域,粟酒裂殖酵母的呼吸作用依赖于线粒体内膜上的呼吸链和氧化磷酸化,电子通过呼吸链上的蛋白复合体进行传递并通过氧化磷酸化产生ATP,呼吸链的蛋白复合体由各种亚基构成,如果有一个或几个亚基无法正常表达,将会引起线粒体呼吸功能紊乱.

本文利用同源重组的方法构建Δcyc2菌株,表型研究发现Δcyc2菌株在以甘油为唯一碳源的培养基上培养时生长受到抑制,这与已报道的CYC2的表型不同,暗示Cyc2蛋白缺失后会影响线粒体的呼吸功能. 研究结果发现Cyc2蛋白的缺失并不会影响线粒体呼吸链蛋白亚基Cox1、Cox2、Cox3、Cob1和Atp6的表达,说明Δcyc2菌株并不是通过影响呼吸链组分来影响线粒体呼吸功能的. 为了解析Cyc2的功能,利用荧光观察和生化方法并结合生物信息学分析来确定该蛋白在细胞中的详细定位. 荧光观察结果表明Cyc2定位于线粒体,随后的生化实验结果发现它定位于线粒体的内膜,最后生物信息学分析结果表明它没有跨膜区域,最终确定该蛋白定位于线粒体内膜,且为外在膜蛋白. 研究认为线粒体内膜外周蛋白Cyc2对于粟酒裂殖酵母线粒体的呼吸是必不可少的,但是其具体的影响途径需要后续实验进一步研究.