孟庆雯,杨 洋,魏俊萍,杨珊珊,黄 珊
(海南医学院第一附属医院心血管内科,海南 海口 570100)
心肌缺血性疾病是世界范围内常见的致死、致残疾病之一[1]。心脏缺血会造成心肌细胞缺氧,线粒体氧化磷酸化过程受阻,导致能量代谢障碍和三磷酸腺苷(ATP)生成减少,引起典型的超微结构和代谢改变,对心肌产生不可逆损伤[2]。目前,对于心肌缺血性损伤的作用机制仍未明确。特异性蛋白1(SP -1)是一种核转录因子,与多种基因的表达相关[3]。金属蛋白酶组织抑制剂-3 可通过EGFR /JNK/SP -1 信号抑制乳鼠心肌细胞增殖,SP - 1 的下调能促进心肌细胞增殖[4]。MicroRNAs(miRNAs)是一种非编码的小RNA,可通过与靶基因mRNA 的3′非翻译区(UTR)结合来调节基因表达,还可参与多种生物学进程,如肿瘤发生、造血和组织损伤[5-6]。miR-135b 通过靶向CACNA1C 改善病理性心肌肥大[7],还可改善心功能受损[8]。缺氧诱导因子1α(HIF -1α)是一种核翻译因子,在缺氧缺血性疾病中起到重要的生物学作用[9-10],可靶向抑制HIF -1α 的表达,参与细菌性脑膜炎星形胶质细胞的发育[11]。本研究中探讨了SP-1 通过miR -135b/HIF -1α 轴对缺氧诱导心肌细胞损伤的作用,为心肌缺血性疾病的治疗提供参考。现报道如下。
仪器:ELx800TM型酶标仪(美国伯腾仪器有限公司);T100 型荧光定量聚合酶链式反应(q-PCR)仪(伯乐生命医学产品<上海>有限公司);Biosciences AccuriC6型流式细胞仪(安诺伦<北京>生物科技有限公司)。
试剂:Dulbecco′s modified eagle medium (DMEM,北京索莱宝科技有限公司);胎牛血清(FBS,赛默飞世尔科技<中国>有限公司);肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素1β(IL -1β)、白细胞介素6(IL -6)酶联免疫吸附( ELISA)试剂盒(上海将来实业股份有限公司);DCFH -DA(西格玛奥德里奇<上海>贸易有限公司);miScript ⅡRT kit(德国凯杰生物科技有限公司);SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒(宝日医生物技术<北京>有限公司);CCK-8 检测试剂盒(东仁化学科技<上海>有限公司);HIF-1α 和GAPDH 抗体(艾博抗<上海>贸易有限公司);HRP 标记二抗(武汉三鹰生物技术有限公司); siRNA 阴性对照(siRNA),SP -1 -siRNA(si-SP-1),miR -136b mimic,mimic 阴性对照(mimic NC),miR -136b inhibitor(anti- miR -136b),inhibitor 阴性对照(anti-NC),HIF -1α 3′-UTR 端序列构建的野生型(WT)和突变型(MUT)报告基因质粒,均由上海吉凯基因化学技术公司构建合成。
细胞:H9c2 细胞(美国模式培养物保藏所)。
细胞培养及转染:H9c2 细胞用含10% FBS 的DMEM 培养基,于37 ℃及5%CO2饱和湿度条件下培养。待细胞密度达到80% ~90%时,0.25%胰酶液消化细胞,含10% FBS 的DMEM 培养基将细胞重悬,将细胞接种于6 孔板内,5 ×104个/孔,于37 ℃及5%CO2饱和湿度条件下培养24 h 后进行细胞转染。配制转染混合液A,将siRNA,si-SP-1,miR-136b mimic,mimic NC,anti- miR-136b,anti-NC 和氯化钴(CoCl2,HIF-1α激活剂)分别用opti-MEM 稀释,总体积为250 μL,siRNA 和si-SP -1 终浓度为100 nmol/L,CoCl2终浓度为50 μmol/L[12],其余序列终浓度为50 nmol/L,混匀,室温孵育5 min;配制转染混合液B,10 μL Lipofectamine 2 000 加入240 μL opti-MEM 中,混匀,室温孵育5 min。将A 液和B 液混匀,室温孵育20 min,加入6孔板内。细胞于37 ℃及5%CO2饱和湿度条件下培养5 h后,更换新鲜培养基,并于正常氧含量(21% O2)或缺氧(3% O2)条件下继续培养48 h 后,进行后续实验。
qRT -PCR 法检测H9c2 细胞中miR -135b 表达:收集缺氧后或转染48 h 后的H9c2 细胞,Trizol 法提取细胞总的RNA,微量分光光度计检测RNA 浓度。应用miScript ⅡRT kit 将1 μg RNA 逆 转 录 成cDNA。按SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒说明,配制25 μL 反应 体 系 。 miR-135b 上 游 引 物 为 5′-CCAGGCTTCCAGTA CCATTAGG -3′,下游引物为5′-GCTTATGGCTTTTCATTCCT -3′;U6 上 游 引 物 为5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′ , 下 游 引 物 为 5′ -AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。反应条件为95 ℃30 s,95 ℃5 s,60 ℃30 s,40 个循环。以U6 为内参,2-ΔΔCt法计算miR-135b 表达。
CCK -8 法检测细胞增殖:将转染后的H9c2 细胞接种于96 孔板中,5 ×103个/孔,细胞于37 ℃及5%CO2饱和湿度条件下培养24 h。向每孔内加入10 μL CCK -8 溶液,37 ℃条件下孵育3 h。利用酶标仪测定450 nm 波长处的吸光度。
流式细胞术检测细胞凋亡:收集转染后的H9c2细 胞,Annexin V - FITC 和PI 室 温 条件 下 避光孵 育15 min,流式细胞仪检测细胞凋亡率。
ELISA 检测细胞TNF -α,IL -1β,IL -6 含量:收集转染后的H9c2 细胞培养物上清液,1 000 r/min 离心20 min,取上清液,按试剂盒说明书检测。
流式细胞术检测细胞内活性氧簇(ROS):H9c2 细胞转染后,移除培养物上清液,加入DCFH -DA(浓度为10 μmol/L),37 ℃条件 下孵育30 min,随后移除DCFH -DA,收集细胞,流式细胞仪检测。
蛋白质印迹(Western Blot,WB)法检测细胞HIF-1α蛋白表达:收集转染后的H9c2 细胞,RIPA 裂解液裂解细胞,12 000 r/min 离心取上清液,BCA 法测定蛋白浓度。取30 μg 样本蛋白进行SDS-PAGE 分离,随后将目的蛋白转至PVDF 膜上。经10%脱脂奶粉封闭后,加入一抗HIF-1α(1 ∶1 000 稀释)和GAPDH(1 ∶1 500),4 ℃下过夜孵育,再加入HRP 标记二抗(1 ∶2 500 稀释)室温孵育1 h 后,ECL 发光、曝光。
荧光素酶报告基因实验检测miR-135b 和HIF-1α靶向关系:针对HIF-1α 3′-UTR 端序列构建野生型(WT)和突变型(MUT)报告基因质粒。依法进行细胞转染,将HIF -1α 的WT 和MUT 载体分别与mimic NC,miR-135b mimic 转染至H9c2 细胞中,48 h 后检测荧光素酶活性。
结果见图1 和表1。与0 h 相比,H9c2 细胞在缺氧条件下分别培养12,24,48,72 h 后,细胞内SP -1 蛋白表达呈时间依赖性显著升高(P <0.05),miR -135b 表达呈时间依赖性显著降低(P <0.05)。
图1 缺氧后H9c2 细胞中SP -1 蛋白的表达水平
表1 缺氧后H9c2 细胞中SP-1 蛋白和miR-135b 表达的变化情况(± s,n =3)
表1 缺氧后H9c2 细胞中SP-1 蛋白和miR-135b 表达的变化情况(± s,n =3)
注:与0 h 相比,a P <0.05。
时间0 h 12 h 24 h 48 h 72 h SP -1 蛋白表达1.032 ±0.144 1.298 ±0.071a 1.360 ±0.115a 1.552 ±0.112a 1.607 ±0.113a miR -135b 表达1.023 ±0.106 0.780 ±0.059a 0.697 ±0.071a 0.512 ±0.058a 0.445 ±0.032a
结果见表2、图2 和图3。与对照组(A 组)相比,缺氧组(B 组)H9c2 细胞中SP -1 的蛋白表达和细胞凋亡率均显著升高(P <0.05),细胞增殖能力显著降低(P <0.05);与缺氧+siRNA 组(C 组)相比,缺氧+si-SP -1 组(D 组)H9c2 细胞中SP-1 的蛋白表达和细胞凋亡率均显著降低(P <0.05),细胞增殖能力显著升高(P <0.05)。
表2 SP -1 低表达对缺氧后H9c2 细胞增殖和凋亡的影响(± s,n =3)
表2 SP -1 低表达对缺氧后H9c2 细胞增殖和凋亡的影响(± s,n =3)
注:与A 组相比,a P <0.05;与C 组相比,b P <0.05。表3 和表4 同。
组别A 组B 组C 组D 组SP -1 蛋白表达1.021 ±0.110 1.467 ±0.055a 1.463 ±0.087 0.238 ±0.039b细胞增殖(%)100.989 ±4.948 67.242 ±3.490a 66.508 ±2.190 83.550 ±2.933b细胞凋亡(%)3.697 ±0.484 14.591 ±1.863a 15.380 ±1.176 4.668 ±0.731b
图2 WB 法检测H9c2 细胞中SP -1 蛋白的表达水平
结果见图4 和表3。与A 组相比,B 组H9c2 细胞上清液中TNF -α,IL-1β,IL-6,ROS 含量均显著升高(P <0.05);与C 组相比,D 组H9c2 细胞上清液中TNF-α,IL-1β,IL-6,ROS 含量均显著降低(P <0.05)。
图3 流式细胞术检测H9c2 细胞凋亡结果
图4 H9c2 细胞中ROS 水平
表3 SP -1 低表达对缺氧后H9c2 细胞炎性因子水平和ROS含量的影响(± s,n =3)
表3 SP -1 低表达对缺氧后H9c2 细胞炎性因子水平和ROS含量的影响(± s,n =3)
组别A 组B 组C 组D 组TNF- (pg/mL)2.289±0.300 5.270±0.359a 5.284±0.561 3.901±0.354b IL-1 (pg/mL)13.387±0.954 25.060±1.212a 25.923±1.431 17.198±1.216b IL-6(pg/mL)28.556±1.761 82.707±4.550a 85.369±3.937 56.742±4.081b ROS 相对含量1.032±0.080 1.239±0.075a 1.264±1.059 1.086±0.090b
结果见图5 和表4。与A 组相比,B 组H9c2 细胞中HIF -1α 的蛋白表达显著升高(P <0.05),miR -135b表达显著降低(P <0.05);与C 组相比,D 组H9c2 细胞中HIF-1α 的蛋白表达显著降低(P <0.05),miR-135b 表达显著升高(P <0.05)。
图5 SP-1 低表达对缺氧后H9c2 细胞中HIF-1 蛋白表达的影响
表4 H9c2 细胞中miR-135b 表达和HIF-1 蛋白表达(X± s,n =3)
miR-135b 与HIF -1α mRNA 3′-UTR 的结合位点见图6。由图7 和表5 显示,与mimic NC 组(E 组)相比,miR -135b mimic 组(F 组)H9c2 细胞中miR-135b表达显著升高(P <0.05),HIF -1α 蛋白表达显著降低(P <0.05),HIF -1α-WT 荧光素酶活性显著降低(P <0.05),而HIF-1α-MUT 荧光素酶活性无明显变化(P >0.05);与anti-NC 组(G 组)相比,anti- miR -135b 组(H 组) H9c2 细 胞 中miR -135b 表 达 显 著 降 低(P <0.05),HIF -1α 蛋白表达显著升高(P <0.05)。
图6 miR -135b 和HIF -1 3′ -UTR 结合位点
图7 miR -135b 对H9c2 细胞中HIF -1 蛋白表达的影响
表5 miR -135b 靶向调控HIF -1 基因(± s,n =3)
表5 miR -135b 靶向调控HIF -1 基因(± s,n =3)
注:与E 组相比,aP <0.05;与G 组相比,bP <0.05。
相对荧光素酶活性组别miR -135b表达HIF -1蛋白表达E 组F 组G 组H 组HIF -1 -WT 1.021 ±0.102 0.425 ±0.039a HIF -1 -MUT 1.011 ±0.101 1.108 ±0.119 1.019 ±0.101 1.742 ±0.097a 0.992 ±0.101 0.424 ±0.040b 1.037 ±0.078 0.411 ±0.031a 0.983 ±0.099 1.319 ±0.071b
结果见图8 和表6。与si-SP -1 组(I 组)相比,si-SP -1 +CoCl2组(J 组)H9c2 细胞中miR -135b 表达无明显变化(P >0.05),HIF -1α 蛋白表达显著升高(P <0.05);与si-SP -1 +anti-NC 组(K 组) 相比,si-SP -1 +anti-miR -135b 组(L 组)H9c2 细胞中miR-135b 表达显著降低(P <0.05),HIF -1α 蛋白表达显著升高(P <0.05)。
结果见图9 和表7。与I 组相比,J 组H9c2 细胞增殖能力显著降低(P<0.05),细胞凋亡率显著升高(P<0.05);与K 组相比,L 组H9c2 细胞增殖能力显著降低(P <0.05),细胞凋亡率显著升高(P <0.05)。
图8 H9c2 细胞中HIF -1 的蛋白表达
表6 H9c2 细胞中miR-135b 和HIF-1 的表达(± s,n =3)
表6 H9c2 细胞中miR-135b 和HIF-1 的表达(± s,n =3)
注:与I 组相比,a P <0.05;与K 组相比,b P <0.05。下表同。
组别I 组J 组K 组L 组miR -135b 表达0.999 ±0.123 1.064 ±0.090a 1.065 ±0.100 0.206 ±0.027b HIF -1 蛋白表达1.009 ±0.117 2.220 ±0.114a 1.075 ±0.071 1.560 ±0.097b
结果见图10 和表8。与I 组相比,J 组H9c2 细胞ROS,TNF-α,IL-1β,IL-6 的含量显著升高(P <0.05);与K组相比,L 组H9c2 细胞ROS,TNF -α,IL -1β,IL -6 的含量显著升高(P <0.05)。
图9 SP -1 /miR -135b /HIF -1 轴对缺氧后H9c2 细胞凋亡的影响
表7 H9c2 细胞增殖和凋亡的变化(± s,%,n =3)
表7 H9c2 细胞增殖和凋亡的变化(± s,%,n =3)
组别I 组J 组K 组L 组细胞增殖100.630 ±6.418 48.470 ±2.831a 93.753 ±6.995 63.728 ±4.192b细胞凋亡15.293 ±0.409 41.076 ±1.117a 16.970 ±0.353 35.935 ±1.776b
图10 SP -1 /miR -135b /HIF -1 轴 对 缺 氧 后H9c2 细 胞ROS 水平的影响
表8 H9c2 细胞上清液中ROS 和炎性因子的含量变化(X± s,n =3)
心肌缺血是急性心肌梗死的常见原因,可引起不可逆的心肌损伤,包括心肌细胞凋亡和氧化损伤[13-14]。缺氧刺激是心血管疾病(如心肌梗死、主动脉瘤和冠状动脉粥样硬化性心脏病)病理生理机制的重要因素[15]。缺氧促进细胞凋亡,负责病理过程中心肌的解剖重塑[16]。缺血引起的缺氧在心肌缺血性疾病期间可诱导心肌细胞凋亡和氧化应激[17]。SP -1 是调控多种基因的关键转录因子,这些基因对疾病的发生和发展至关重要[18]。SP -1 可促进缺氧后血管内皮细胞中环氧合酶2 的表达,从而促进环氧合酶2 在主动脉瘤和心力衰竭中的局部表达[19]。SP-1 与心脏疾病密切相关,但其对缺氧后心肌细胞损伤的作用尚不清楚。
研究表明,SP -1 与心肌细胞的增殖相关[4],SP -1的激活与炎症和心脏肥大相关[20]。本研究结果显示,干扰SP -1 表达可减轻缺氧诱导的心肌细胞损伤。miRNA是一种小的、内源性非编码RNA 分子。 临床研究和动物实验表明,miRNA 是心脏缺血的潜在生物标志物和治疗靶标[21]。 此外,一些miRNA 在心肌细胞程序性死亡中起调节作用[22]。心肌梗死可上调心脏SP -1 的表达,miR-7 a/b 通过抑制SP -1 的表达在心肌梗死诱导的心肌缺血和心室重构中发挥保护作用[23]。miR -135b 是心肌缺血再灌注损伤的重要调节剂[24],其过表达改善心功能受损,抑制NLRP3 /caspase-1 /IL -1β途径的上调[8]。SP -1 和HIF -1α 同时抑制缺氧状态下人微血管内皮细胞(HMEC-1)的增殖、迁移和侵袭[25]。本研究结果显示,SP -1 是miR -135b 和HIF -1α 的上游基因,可调控miR -135b 和HIF -1α 的表达。miR -135b 可靶向调控H9c2 细胞中HIF -1α 蛋白表达,这与SUN 等[6]的研究结果一致。
眼部的慢性低氧/复氧损伤会导致HIF -1α 水平上调,奥拉帕尼可通过降低HIF -1α 水平发挥视网膜保护作用[26]。抑制HIF-1α 表达可减轻低氧性肺泡上皮细胞的炎性反应[27]。右美托咪定通过抑制HIF-1α抑制大鼠神经元细胞凋亡,改善脑缺血再灌注损伤[28]。miR -135b 过表达促进人脐静脉内皮细胞增殖,抑制凋亡[29]。体内和体外心肌细胞损伤后,miR -135b 的表达均下调,miR-135b 过表达可显著抑制ROS 的产生和NLRP3 /caspase -1 /IL -1β 炎症通路的上调[8]。本研究结果显示,CoCl2和anti-miR -135b 会逆转低表达SP-1 对缺氧H9c2 细胞的保护作用。低表达SP -1 通过miR-135b 抑制HIF-1α 的表达,发挥对缺氧诱导的心肌细胞损伤的保护作用。
综上所述,SP-1 低表达通过miR -135b/HIF-1α轴发挥对缺氧诱导的心肌细胞损伤的保护作用。此结果可为进一步明确心肌细胞损伤机制和心肌缺血性疾病的治疗提供参考。后续研究中将进一步探讨SP-1 低表达通过miR -135b/HIF -1α 轴在心肌缺血性疾病动物模型中的作用。