麝香酮对原代大鼠脊髓神经细胞的保护研究

郭亮 桂菲 李睿夫 于超 罗远盟

【摘  要】目的：评估麝香酮对原代大鼠脊髓神经细胞的保护作用。方法：采取2mm间距行“井”法对培养的星形胶质细胞进行划伤，建立星形胶质细胞的机械损伤模型，在模型中加入500mmol/l谷氨酸共培养，建立星形胶质细胞机械-化学损伤模型，分别在6h、12h、24h、48h、72h作MTT检测。实验分组：A组（单纯培养），B组（机械化学损伤组），C组（B组中加入3ug/ml麝香酮），D组（B组加入6ug/ml麝香酮），E组（B组加入12ug/ml麝香酮），在3h、6h、12h时检测 SOD、MDA、LDH及细胞内Ca2+。结果：获得了95%以上的高纯度的脊髓星形胶质细胞。建立了大鼠原代脊髓星形胶质细胞机械化学损伤模型。SOD检测提示：A组无明显的变化，B组明显的下降，C、D、E组比B组高，以D组在同一时间点最明显。MDA检测提示A组无明显的变化，B组比A组升高，C、D、E组比B组明显低，D组在同一时间点最低。细胞内钙检测与MDA有类似的变化，C、D、E组与A组和B组有显著性差异（P<0.05）。结论：不同浓度的麝香酮对机械-化学损伤的星形胶质细胞都有保护作用，以6ug/ml浓度效果最好。

【关键词】麝香酮，星形胶质细胞，炎症反应，保护

创伤性脊髓损伤（trauma spinal cord injury， SCI）的发病率有逐渐升高的趋势 [1]，SCI 及其继发性损伤可直接导致神经功能损伤，出现不同程度的功能障碍，并且脊髓损伤治疗困难[2]， 因此致残率与致死率非常高[3] 。脊髓损伤后炎症因子会刺激星形胶质细胞的增殖和活化[4]。过度生长的星形胶质细胞也会形成胶质疤痕，作为物理和化学屏障阻止神经元轴突再生[5]。减轻继发性损伤的关键是保护损伤细胞，抵抗炎症，减少星形胶质细胞的增殖。麝香酮具有类似糖皮质激素的抗炎作用。它能抑制中性粒细胞释放炎症因子，降低钙强度[6]。通过血脑屏障，提高中枢神经系统的耐缺氧能力，减轻水肿。Yu等人的Invitro实验表明，麝香酮可以减少LDH的释放，抑制钙的流入，并提高细胞在超剂量Glu处理的PC-12细胞中的存活率[7]。Jin等人的实验表明，麝香酮可以减轻脑缺血的水肿，减轻脑细胞的病理变化[8]，说明麝香酮具有一定的抗炎作用和对中枢神经系统的保护作用。

本实验中选用大鼠脊髓原代星形胶质细胞进行体外培养，并建立损伤模型，运用不同浓度的麝香酮对星形胶质细胞损伤作用，检测TNF-α、IL-1B、SOD、MDA，LDH、细胞内钙的测量及对细胞进行计数，探讨麝香酮对脊髓星形胶质细胞保护作用。

1.材料与方法

1.1原代脊髓星形胶质细胞的分离及纯化

取新生乳鼠10只无菌条件下剪刀断头，打开脊椎后完整取出脊髓组织。将脊髓组织剪碎致直径0.1mm左右小块化学消化收集细胞悬液。弃去上清液，然后每管加入2-3 ml含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基，接种于培养瓶中，37℃、5%CO2培养箱内孵育60分钟，进行差速粘附贴壁处理，以去除成纤维细胞。 24小时后翻转培养瓶收集的贴壁细胞，继续培养即可得纯度达到95%以上的星形胶质细胞培养箱内培养，生长8-10d待细胞融和，随后使用本次获得的细胞进行传代，用于后继实验。

1.2免疫荧光染色法行细胞的鉴定：胶质纤维酸性蛋白（GFAP）

细胞准备好后进行 细胞铺片， 吸除培养瓶中旧培养基，用PBS洗2-3次，加入0.25%胰酶消化液约1-3ml进行消化，置37℃培养箱静置约2-5分钟，加入2-3ml完全培养基，收集细胞至离心管，离心5min，弃上清加培养液，调整细胞密度为1*106个/ml，以每孔0.5ml接种到6孔板的盖玻片上。待细胞12h贴壁后，吸出培养基，生长达到70%-80%，最后爬片固定，中性树胶封片。

1.3星形胶质细胞的机械化学损伤模型

（1）建立星形胶质细胞机械损伤模型

待细胞贴壁后用1ml无菌注射器针头，在4倍放大镜下进行直线划伤培养皿中脊髓星形胶质细胞，整个过程要求力度适中以保证损傷较为一致。于六孔板呈“井”字划伤，划痕线之间的平行间距为0.2mm，细胞损伤前30min加入不同浓度的麝香酮进行药物预处理划。倾斜培养皿，极其轻柔的吸去划伤后所有的培养基。

（2）星形胶质细胞的机械化学损伤模型

在机械损伤模型中加入500umol/L谷氨酸造成细胞机械化学损伤模型。常规继续培养。在加入Glu前30 min加入3 ug/ml、6 ug/ml、12 ug/ml 的麝香酮进行药物预处理。

（3）损伤模型的鉴定

台盼蓝染色法测定细胞死亡率

在三分钟内，分别计数活细胞和死细胞。镜下观察死细胞被染成明显的蓝色，而活细胞拒染呈无色透明状。 统计细胞活力：活细胞率（%）= 活细胞总数/（活细胞总数+死细胞总数）×100%。细胞死亡率的计算：细胞死亡率（%）=死细胞数/（活细胞数+死细胞数）×100%。

（4）星形胶质细胞的实验分组

A组（单纯培养），B组（机械化学损伤后继续培养），C组（B组加入3ug/ml麝香酮500ul/孔），D组（B组加入6ug/ml麝香酮500ul/孔），E组（B组加入12ug/ml麝香酮500ul/ml孔）.

（5）监测指标

在不时的时间点采用ELISA 法对对MDA、SOD检测和流式检测法细胞内Ca2+的浓度。

（6）统计学处理

采用SARS9.0统计软件包进行分析，所有数据以±s表示，组间比较采用单因素方差分析，P值<0.05为有统计学意义。

2.结果

2.1获取高纯度的脊髓星形胶质细胞

在更换培养液时行10秒短期暴露与差速贴壁法相结合的方法，获取了纯化后的脊髓星形胶质细胞。采用胶质纤维酸性蛋白（GFAP）免疫化学细胞染色鉴定，在培养3天时在光镜下观察见星形胶质细胞主要呈梭形、不规则形态或星形，细胞质丰富、细胞核大，染色质浅而均匀，多为1个核仁，偶见有2个核仁。其胶质细胞纯度达95%以上。 （图1）。

2.2成功建立了原代星形胶质细胞机械化学损伤模型

采用台盼蓝染色法测定细胞死亡率。正常組培养6小时、24小时未见死亡细胞。在6小时机械损伤模型死亡率在13.23%，细胞存活率87.73%;在机械化学损伤模型后死亡率在21.12%，细胞存活率78.88%;24小时，在机械损伤模型死亡率在23.57%，细胞存活率76.43%;在机械化学损伤模型后死亡率在36.27%，细胞存活率63.73%。

2.3细胞流式法检测细胞内Ca2+

正常组在同一时间点最低，有缓慢上升; 模型损伤组明显增加，在3h、6h、12h荧光值分为22.67、30.00、31.03，处理组中都明显的下降，以D组在同一时间点最明显，在分别为17.21、25.21，25.31。 （图2）

2.4 ELISA法检测丙二醛（MDA及超氧化物歧化酶（SOD）

脊髓星形胶质细胞在体外培养过程中，正常组无明显的变化，机械化学损伤组较正常组明显的下降在3h、6h、12h，分为72.11 ng/L、76.55ng/L、85.56ng/L，处理组中都明显的下降，以麝香酮6ug/ml组在同一时间点最明显，在3h、6h、12h达55.56 ng/L、51.89ng/L，78.94ng/L。处理组与正常组和损伤组有显著性统计学差异（图3）。脊髓星形胶质细胞在体外培养过程中，正常组无明显的变化，机械化学损伤组明显下降在3h、6h、12h，分为28.52 ng/L、24.53ng/L、22.33ng/L，处理组中都明显的提升，以麝香酮6ug/ml组在同一时间点最明显，在3h、6h、12h达46.74 ng/L、42.01ng/L，38.33ng/L。处理组与正常组及损伤组有显著性统计学差异（P<0.01）。（图4）

3.讨论

3.1细胞培养与鉴定

对原代神经细胞培养研究，是研究脊髓损伤机制的主要方法之一[1]。脊髓损伤后所引起的一系列炎性反应及对伤脊髓的保护作用，很大程度上通过星形胶质细胞起作用。获得较为单一高纯度的星形胶质细胞是进行深入研究的基础，选用新生大鼠也有利于获得高纯度的星形胶质细胞， 因为星形胶质细胞的分裂高峰发生在动物胚胎晚期及出生以后[9]。差速贴壁法[10]是利用星形胶质细胞、成纤维细胞与嗅鞘细胞的贴壁时间不同而将它们分离的方法。成纤维细胞的贴壁能力强，在未被包被的光滑玻璃平面上，在细胞接种1小时之内就可直接贴壁，星形胶质细胞一般在接种的24h左右贴壁，而嗅鞘细胞则需要96-120h内贴壁。本实验选择，通过两次恒度摇床振荡，神经细胞、少轴突细胞、小胶质细胞。星形胶质细胞能在无培养液状态下能成活40小时[11]，将培养液吸干换液时，使培养细胞暴露于空气中10秒钟可以除去少突胶质细胞[12]。但是为了提高星形胶质细胞的生存能力、活性及传代能力，在更换培养液时注意避免过长的暴露时间。因为一般在原代培养时采用相对较低的接种密度，因神经元不再分裂增殖，且传代后大多会死去。

本实验采用星形胶质细胞标志性蛋白：胶质纤维酸性蛋白（GFAP）行行细胞免疫化学染色来鉴定，通过计数统计，星形胶质细胞的纯度达95%，获得了纯度较高的星形胶质细胞，能满足本次实验的要求。若要得到纯度更高的星形胶质细胞，而又不影响星形胶质细胞的培养，可采用聚合酶链反应法 。

3.2细胞损伤模型的选择

本实验通过张杰敏[12]等提供的方法成功的建立体外星形胶质细胞机械损伤模型[16]，直接的损伤致坏死，损伤缘的胶质增生肥大明显，对于未损伤区，细胞形态正常，说明损伤的程度不重，而选用20ul移液器吸头作划伤时的工具，有大量的胶质细胞被拖至划痕的尾端，实验损伤的程度不重，后改用针头后检测量SOD、MDA较前有明显变化。考虑到单纯机械损伤因没有与其它细胞共培养，培养缺乏在体损伤时可因神经元损伤，在多种因素介导下出现谷氨酸的增加，不能模拟其脊髓损伤后的病理状态，同时单独作谷氨酸诱导下的的化学损伤，可能又缺少机械因素下的细胞直接的损伤，及损伤所诱导下的病理生理变化，都不能很好的模拟临床上的微环境变化，故本实验选用了机械损伤后再加入谷氨酸，建立了脊髓星形胶质细胞机械化学损伤模型，进行研究。

3.3麝香酮的作用效果

在机械化学损伤下，脊髓星形胶质细胞出现机械性损伤造成细胞原发性损伤，LDH是细胞无氧酵解过程中的一种关键酶，在机械化学损伤的作用下，当细胞膜完整性遭到破坏时，细胞膜通透性增高，胞的大量LDH从浆中释放到细胞外，并与细胞损伤程度呈正相关。因此，将LDH释放量作为评价星形胶质细胞受损伤的一般指标。同时培养液中大量的谷氨酸和机械损伤所引起的细胞损害，激活了细胞膜上的谷氨酸转动蛋白，钙内流增加致，线料体内的钙增加，引起细胞膜及细胞器脂质代谢异常，细胞膜及细胞器脂代谢产物MDA大量产生，自由基大量释放，消耗了大量的SOD，出现SOD急剧下降。触发星形胶质细胞增生，释放TNF-α等炎症因子，又反馈加重细胞损伤。而这类炎症因子可以作为炎症反应被激活的标志物。

麝香酮是一种有效的抗炎剂，能降低免疫炎症细胞因子，包括IL-6、IL-B、TNF-α、基质金属蛋白酶、环氧化酶、NO等的水平， PC12细胞降低钙内流。本次实验结果显示，3-12ug/ml麝香酮处理后都减少由机械化学损伤所致的的细胞损伤，降低了LDH漏出，抑制了MDA的释放，增加了SOD产量。麝香酮能明显抑制机械化学损伤所引起的脊髓胶质细胞的炎症反应。但其作用机制不清楚，需进一步深研究。

（通讯作者：桂菲）

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项目基金：课题来源于重庆市科委自然基金，基金号：cstc2016jcyjA0299。

作者简介：郭亮，1975-，男，重庆人，博士，骨科副教授/副主任医师，研究方向：脊柱脊髓的损伤，主要从事脊柱外科疾病的诊治及髋/漆关节置换手术，颈、腰椎退变中医药治疗。