添加黄芪超细粉和抗生素对瘤胃体外发酵的影响

魏海燕，王宪举，闫 琦，姜翠霞，丁路明，2*，赵索南

(1. 兰州大学 草地农业生态系统国家重点实验室/生命科学学院，兰州 730000；2. 青海大学 青海省高寒草地适应性管理重点实验室，青海 西宁 810016；3. 青海省海北州畜牧兽医科学研究所，青海 西海 810299)

近年来通过营养调控措施达到增强动物的免疫机能和抗病能力，缓解应激引起的生产性能下降，已经成为畜牧业亟需解决的问题[1]。植物活性多糖具有调节机体免疫功能、抗菌、抗病毒及抗炎等活性作用[2]。中草药作为动物饲喂的添加剂既有营养作用，也有药用作用，可以提高动物生长性能也能保护动物健康[3]。其主要机理是调动机体的免疫功能和对全身性治疗的抗病能力[4]。黄芪含有多糖、黄酮、氨基酸及微量元素和皂苷类等具有抗肿瘤作用的营养成分[5]。黄芪作为临床所用的一种补益中药，具有利水退肿、补脾益气和固表止汗的功能，是一种临床用于治疗肝癌的中药之一[6]。反刍动物被饲喂抗生素以保持瘤胃发酵平衡，但饲喂抗生素存在着动物机体内的残余问题以及耐药性的问题[7],越来越多的植物源添加被用于动物饲料的研究。本试验通过分别在模拟瘤胃体外发酵中添加黄芪和四环素，研究对体外干物质消化率、瘤胃发酵参数以及瘤胃微生物的影响，为黄芪作为中药饲料添加剂用于反刍动物饲喂提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料及前处理

苜蓿和黄芪采自甘肃省陇西县；四环素(注射用盐酸四环素)购买于北京赛孚制药有限公司。本试验以苜蓿干草粉作为培养底物，苜蓿经过65℃烘干后粉碎过1 mm网筛备用。黄芪经过65 ℃烘干后，进行切段处理，磨成超细粉(200目)。苜蓿与黄芪的营养成分见表1。

1.2 瘤胃液采集与处理

试验选取6头健康的、年龄相近、体重为200±10 kg的牦牛，自由采食，其日粮组分见表2。于08:00晨饲前使用自制瘤胃软导管分别采集6头牦牛

表1 底物和添加剂的营养水平(干物质基础)

表2 试验动物饲粮组成及营养水平(干物质水平)

瘤胃液300 mL/头，经4层纱布过滤后一部分分装入3个10 mL离心管中投入液氮罐带回实验室低温储存；一部分过滤到39 ℃预热的保温瓶中，并混合均匀，迅速运回实验室。

1.3 试验设计

准确称取苜蓿干草粉0.5 g (W1)于滤袋中，并记录总重(W2)。试验设置三个处理：在发酵液中以空白、添加黄芪超细粉、添加抗生素作为三个处理。其中黄芪粉和四环素的添加量为苜蓿草粉的5%DM。每个处理三个重复。以 Daisy II 培养箱 Daisy PII P Incubator体外模拟培养箱的要求进行缓冲溶液的配制，称取苜蓿干草粉的滤袋封口后放置于Daisy II培养箱消化罐中 (每个罐放置25个样品)。将盛有样品和缓冲溶液的消化罐放置于Daisy II培养箱中，允许消化罐的温度在20～30 min达到平衡。分别加入400 mL混合均匀的瘤胃液在缓冲溶液和样品中。分别在体外发酵12 h、24 h和48h进行发酵液和滤袋的收集，进行后续分析。

1.4 样品分析与检测

1.4.1 试验材料的化学成分分析 干物质含量采用烘干法进行测定[8]；粗灰分测定参照《饲料分析及饲料质量检测技术》(第三版)[9]；粗蛋白质采用凯氏定氮仪(JK-9830，中国)进行测定；中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维采用ANKOM 2000i全自动纤维分析仪进行测定；粗脂肪用乙醚浸提法进行分析[10]。

1.4.2 体外干物质降解率 分别取12、24、48 h体外发酵后的滤袋，在25～39 ℃的温水中洗涤尼龙袋，用玻璃棒不断搅拌,不断换水直至洗涤用水无色为止,在65 ℃烘箱中烘48 h后，回潮称重。

体外干物质降解率(V)： = (W2-W3) / W1

式中：W1:苜蓿干草粉重(g);W2:苜蓿干草粉和滤袋的总重(g):W3:体外发酵后苜蓿干草粉和滤袋的总重(g)。

1.5 瘤胃液发酵参数

1.5.1 瘤胃液pH和挥发性脂肪酸(VFA) 从Daisy II培养箱取下消化罐，立即进行pH的测定(雷磁PHS-29A)。瘤胃液于4 ℃冰箱解冻，漩涡混匀，取上清液于10 mL离心管中进行离心(2 000 g，10 min),取上清液1 mL置于1.5 mL离心管中，加入0.2 mL去蛋白溶液，混匀，冰水浴中静置30 min，4 ℃下离心(10 000 g,10 min)，冰水浴储藏待用。使用微量进样器进样，气象色谱仪(AP-3201A)对瘤胃VFA进行分离，后续试验步骤及气相色谱条件参考周建伟[11]的方法。

1.5.2 瘤胃液氨态氮NH3-N 取瘤胃液4 mL放入4 ℃ 冰箱中解冻，加入0.3 mL65%(wt/vol)的三氯乙酸，摇匀，之后将样品放置在冰盒里30 min，随后将样品在4 ℃、28 000 g的条件下离心15 min，取上清液用U-2900分光光度计在630 nm波长下测定NH3-N浓度。

1.6 瘤胃微生物的多样性

将瘤胃液原液以及发酵过的瘤胃液送于北京百迈克生物科技有限公司进行微生物检测，主要操作步骤包括：首先对DNA样品进行提取、PCR扩增和纯化；得到优化序列；将优化序列进行聚类，划分OTU，并根据OTU的序列组成得到其物种分类；通过Alpha多样性分析研究单个样品内部的物种多样性，统计了各样品在97%相似度水平下的Chao和Shannon指数。

1.7 数据分析与处理

在Excel中作数据的基本处理，应用SPSS 20.0进行ANOVA方差分析和LSD多重比较，数据表示为平均值，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。

2 结 果

2.1 黄芪粉对模拟瘤胃体外发酵消化率的影响

由表3知，在发酵过程中，对照组和黄芪组的消化率极显著升高，而四环素组差异不显著。在12、24、48 h各个时间点，黄芪组显著高于其他两组，且在24和48 h对照组显著高于四环素组(P<0.05)。

2.2 黄芪粉对模拟瘤胃体外发酵指标的影响

如表4所示，每个处理组随着发酵时间延长pH均下降，其中12～24 h显著下降。在各个发酵时间点，四环素发酵组的pH均显著高于其他两组(P<0.05)。随着发酵时间延续，对照组和四环素组的NH3-N极显著上升(P<0.01)；而黄芪组显著下降(P<0.05)。随着发酵时间延续，对照组和黄芪添加组总挥发性脂肪酸(TVFA)均极显著上升(P<0.01)，而四环素组显著下降(P<0.05)；在体外发酵的各个时间点，黄芪组TVFA显著高于其他两组，且对照组显著高于四环素组(P<0.05)。随着发酵时间延续，对照组和四环素组乙酸和丙酸在24～48 h极显著下降(P<0.01)，而黄芪组显著上升(P<0.05)。随着发酵时间延续，各处理组乙酸/丙酸含量显著下降(P<0.05)；在12和24 h，对照组和黄芪组显著高于四环素组，而对照组和四环素组差异不显著；在48 h，黄芪组显著高于其他两组，对照组显著高于四环素组(P<0.05)。

表3 添加黄芪粉和抗生素在不同模拟瘤胃体外发酵时间的干物质降解率/%

注：同行数据肩标不同大写字母表示差异显著(P<0.05)，同列数据肩标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下同。

Note: Different lowercase letter superscripts in the same row mean significant difference(P<0.05)，different capital letter superscritps in the same column mean significant difference (P<0.05). The same below.

表4 添加黄芪粉和抗生素对模拟瘤胃体外发酵液指标的影响

2.3 瘤胃微生物

2.3.1 黄芪粉对体外发酵瘤胃微生物多样性的影响 由表5可得，随着发酵时间延续，对照组和四环素组随着发酵时间延续OTU数显著降低，而黄芪组显著升高；在发酵12 h，对照组和四环素组显著高于黄芪组；在发酵24和48 h，黄芪组显著高于其他两组，且对照组显著高于四环素组(P<0.05)。黄芪组随着发酵时间延续，Chao指数12～48 h呈现出“U”形的变化趋势；香农指数显著上升(P<0.05)。对照组和四环素组随着发酵时间延续，Chao指数极显著降低(P<0.01)；香农指数在12～24 h显著降低(P<0.05)。在发酵12 h，对照组和黄芪组的Chao指数显著高于四环素组，对照组和四环素的香农指数组显著高于黄芪组；在发酵24和48 h，黄芪组的Chao指数和香农指数显著高于其他两组，且对照组显著高于四环素组(P<0.05)。

表5 添加黄芪粉和抗生素对瘤胃微生物OTU数和Alpha多样性的影响

2.3.2 黄芪粉对模拟瘤胃体外发酵瘤胃门水平微生物群落结构的影响 由图1(左)可见，在门水平上，各组体外发酵液中的优势菌群均为拟杆菌(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria)。由表6可得，拟杆菌(Bacteroidetes)在发酵各个时间点黄芪组显著高于其他两组。厚壁菌门(Firmicutes)在发酵过程中，对照组和黄芪组显著升高，而四环素组显著下降。变形菌门(Protecbacteria)在发酵过程中对照组极显著下降(P<0.01)，且在发酵的各个时间点，四环素组显著高于其他两组(P<0.05)，且对照组显著高于四环素组(P<0.05)。

2.3.3 黄芪粉对体外发酵瘤胃属水平的微生物群落结构的影响 由图1(右)可得，在属水平上，对照组和黄芪组体外发酵液的优势菌群为普雷沃氏菌属_1(Prevotella_1)、肠杆菌属(Enterobacter)和理研菌科(Rikenellaceae_RC9_gut_group)，四环素组体外发酵液的优势菌群为肠杆菌属(Enterobacter)和埃研氏志贺氏菌(Escherichia-Shigella)。对照组的普雷沃氏菌属_1(Prevotella_1)在发酵24 h显著升高，而黄芪组在发酵过程中显著降低。对照组的肠杆菌属(Enterobacter)在发酵过程中显著降低，而四环素组在发酵24 h显著升高(P<0.05)。对照组和黄芪组的理研菌科(Rikenellaceae_RC9_gut_group)在24 h显著降低(P<0.05)，而四环素在发酵过程中极显著降低(P<0.01)。四环素组的埃研氏志贺氏菌(Escherichia-Shigella)在发酵过程中极显著升高(P<0.01)。

图1 瘤胃微生物在门(左)和属(右)水平上的相对丰度

表6 添加黄芪粉和抗生素对于优势瘤胃细菌相对丰度的影响(门水平)

3 讨 论

3.1 黄芪粉对模拟瘤胃体外干物质降解率的影响

饲料降解率是对饲料利用效率的一个重要衡量，Deng等[12]在用体外发酵法研究不同浓度的黄芪根部提取物对体外干物质降解率的影响研究中发现，黄芪根部提取物的添加，使得体外发酵的干物质降解率显著升高。在本试验中，黄芪组的体外消化率在各个时间段均高于对照组和四环素组，本试验与其研究结果一致，其原因可能是黄芪作为一种中草药所含的活性物质有利于饲料的降解。

3.2 不同处理对瘤胃体外发酵指标的影响

正常的反刍动物瘤胃液pH维持在6～7之间，本试验中pH的变化范围在6.33～6.61之间，属于正常范围，说明黄芪和四环素的添加未对瘤胃发酵产生不良的影响，随着发酵时间延续，瘤胃液pH处于下降趋势。这是由于在体外发酵中，持续产生的VFA会在发酵罐中积累，所以使得在试验结束时pH降低[13]。

瘤胃液NH3-N是对瘤胃液氮代谢的重要衡量标准，其浓度高低可反应饲料蛋白的降解和微生物蛋白的合成情况[14]。本试验中，对照组和四环素组NH3-N随着发酵时间的延续逐渐升高，但黄芪组逐渐降低，黄芪组比其他两组多添加了黄芪，随着发酵，微生物蛋白含量升高，使得黄芪组的NH3-N在12 h高于其他组，且随着发酵NH3-N浓度降低，这就说明黄芪组的微生物蛋白合成速度大于饲料蛋白降解的速度。但四环素组NH3-N含量逐渐升高，可能表示着四环素组微生物蛋白合成速度大于对照组，也可能是由于四环素组抑制了饲料蛋白的降解。

表7 随着体外发酵时间的延续添加黄芪粉和抗生素在属水平上优势瘤胃微生物数量的变化

瘤胃液中的VFA是有机体在发酵过程中的重要产物，为反刍动物维持正常的新陈代谢提供了能源物质[15]。随着发酵时间延续，对照组和黄芪组的TVFA显著升高，而四环素组差异不显著，但呈上升趋势。且在各个时间点黄芪组高于对照组，说明黄芪组的发酵罐中最为活跃，能为反刍动物育肥提供丰富的脂肪合成底物。本试验对照组和黄芪组其中12～24 h增长比24～48 h增长快，这与瘤胃微生物活性有关，微生物在指数型生长之后，生长速度趋于平缓，然后进入衰退期[16]。本试验结果说明，黄芪组在体外发酵中产生了正组合效应，有利于微生物对饲料的降解[15]，且分解速度快，发酵迅速，使得乙酸和丙酸含量提高。有研究表明，在VFA中丙酸含量上升，说明瘤胃在消化后能量的利用率提高，黄芪组的乙酸/丙酸大于3，此组的发酵模式属于乙酸型[15]。因此黄芪组更有利于VFA的生成。

3.3 瘤胃微生物

瘤胃微生物通过一系列复杂的生化反应，把饲料所含有的营养物质转化为挥发性脂肪酸以及微生物蛋白，从而为反刍动物提供能源[17]。微生物的多样性研究主要基于编码核糖体RNA核酸序列保守区进行的[18]。细菌主要基于16S区。OTU是认为设计的一个分类单元，其中每一个OTU代表一种序列。Chao指数是衡量物种丰富度即物种数量的多少；Shannon指数用于衡量物种多样性[19]。在本试验中，随着发酵时间延续，黄芪组OTU数显著增高，而对照组和四环素组显著降低，且黄芪组的OTU数显著高于其他两组。随着发酵时间延续，对照组和四环素组的Chao指数和Shannon指数显著降低，且黄芪组的Chao指数显著高于对照组和四环素组；黄芪组的Shannon指数显著高于其他两组。说明黄芪的添加显著提高了瘤胃细菌的多样性，而四环素组显著抑制了瘤胃细菌的生长与繁殖。

在瘤胃细菌群落中，拟杆菌门、厚壁菌门和变形菌门是3大优势菌群[20]。李烨青等[16]基于16S-rRNA分析了奶牛体外发酵瘤胃微生物区系变化的研究表明拟杆菌的相对丰度会在12 h后降低，而厚壁菌在12 h时升高，这与本试验的黄芪组的研究结果一致。本试验中，黄芪组的拟杆菌门显著降低、厚壁菌门显著升高，而对照组组两者都降低，四环素组两者都升高，说明黄芪的添加有助于牦牛对于能量的摄取、转化和储存，而四环素组抑制了厚壁菌的生长。很大一部分变形菌门的菌属可以与其它菌属竞争生存，同时也能在低碳条件下适度生存[21]，所以随着发酵时间的延续，蛋白质和淀粉等物质基本被降解，变形菌的相对丰度也会相对增加，这与本试验的四环素组的研究结果是一致的。普雷沃氏菌属于拟杆菌门，其可以在瘤胃内降解并利用淀粉和植物细胞壁多糖，但是不可以降解纤维素[22]。Li[23]认为普雷沃氏菌属在降解纤维方面发挥着潜在作用，其会受到活性比较高的纤维分解菌的抑制，这也就意味着普雷沃氏菌属的相对丰度随着发酵时间延续而先升高后降低。而在本试验中，CK组与这个研究结果一致，而黄芪组和四环素组显著降低，且四环素组在各个体外发酵时间段低于其他两组，这可能是由于四环素组抑制了普雷沃氏菌。

肠杆菌属主要用于发酵葡萄糖。在本试验中对照组的该菌属显著降低，而黄芪组的该菌属含量很少，而四环素组其菌属显著升高，说明黄芪的添加抑制了该菌的生长，而四环素组却与黄芪组相反。说明四环素的添加可能有利于该菌属的生长。Rikenellaceae_RC9_gut_group属于理研菌科，主要作用是碳水化合物和蛋白质的发酵[24]。在本试验中对照组其先下降后上升，黄芪组先下降后趋于平稳，而四环素组显著下降。说明四环素的添加显著降低Rikenellaceae_RC9_gut_group的活性。埃希氏志贺氏菌属于变形菌门属，对照组和黄芪组的埃希氏志贺氏菌相对丰度很少；但四环素组随着发酵时间延续，到24 h其相对丰度显著升高，并且与变形菌的变化趋势相一致，说明在变形菌门中埃希氏志贺氏菌起着很大的作用。

4 结 论

(1)在瘤胃体外发酵液中添加黄芪超细粉，提高了体外干物质降解率；(2)在瘤胃体外发酵液中添加黄芪超细粉，增加了总挥发性脂肪酸浓度、乙酸与丙酸的比；(3)在瘤胃体外发酵液中添加黄芪超细粉，提高了微生物的相对丰度和多样性，在门水平上优势菌群为拟杆菌门、厚壁菌门和变形菌门；属水平上的优势菌群为普雷沃氏菌属和Rikenellaceae_RC9_gut_group。且黄芪超细粉的添加提高了发酵罐中厚壁菌门的丰度，降低了拟杆菌门的丰度。