静脉滴注心房利钠肽对阿勒泰羊血液生理生化指标的影响

陈 勇，韩 冰,2，马维英，杨 斌

(1.新疆农业大学 动物科学学院，乌鲁木齐 830052；2.新疆畜牧科学院生物技术研究中心，新疆维吾尔自治区动物生物技术重点开放实验室，乌鲁木齐 830011)

利钠肽 (natriuretic peptides) 家族成员主要包括心房利钠肽(Atrial natriuretic peptide，ANP)、B-型利钠肽或脑钠肽(B-type natriuretic peptide或brain natriuretic peptide，BNP)和C型利钠肽(C-type natriuretic peptide，CNP)。ANP由心房肌细胞分泌，通过利钠利尿、舒张血管、增加内皮细胞通透性和拮抗肾素-血管紧张素-醛固酮系统的方式调节血压，此外还具有抑制心肌肥大的作用[1]。

ANP与利钠肽受体A(natriuretic peptide receptor A，NPR-A)结合通过激活cGMP依赖性蛋白激酶 (cGMP-dependant protein kinase，PKG) 促进人脂肪细胞脂解[2]。一直以来，人们认为脂肪的脂解由儿茶酚胺激活cAMP依赖性蛋白激酶 (cAMP-dependant protein kinase，PKA) 途径介导。由此可见，ANP促脂解的信号通路与儿茶酚胺完全不同。这提示，该途径可能成为控制人及动物脂肪沉积的一条新途径。在促脂解作用中，ANP的作用远强于其他来源于家族成员[3]，并一度被认为是灵长类动物所特有的现象[4]。但有研究发现，ANP也促进啮齿类动物的脂解[5-6]。绵羊也产生利钠肽[7-8]。灌注低剂量的BNP，导致绵羊血液中cGMP水平显著升高[9]。ANP是否影响绵羊脂肪代谢还未见报道。本研究对绵羊滴注化学合成的ANP，以观察ANP对绵羊糖、脂和蛋白质代谢相关血液生理生化指标的影响，为进一步阐明ANP在绵羊生理中的作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 ANP的合成

根据绵羊ANP的氨基酸序列[1]，由生工生物工程(上海)股份有限公司采用化学法合成并进行Cys7和Cys23间二硫键修饰。合成的多肽经HPLC纯化后纯度为95.23%。ESI质谱检测表明合成的ANP氨基酸顺序与绵羊的ANP相同，分子量为3020.40 Da。ANP经冷冻干燥后于-20 ℃保存备用。

1.2 试验动物与饲养管理

选取11月龄、体重为(57.5±3.3)kg的阿勒泰大尾羊10只。参照舍饲条件下中国肉羊饲养标准[10]设计饲粮配方，饲粮配方及营养水平见表1。试验动物单栏饲养，分别于09:00和21:00饲喂精料补充料和粉碎玉米秸秆各0.45 kg。饲喂时先粗后精，自由饮水。

表1 日粮配方及营养水平(风干基础)

注：预混料为每千克日粮提供：维生素 A1350 IU，维生素 D262.5 IU，维生素 E4500 IU，铁16 mg，铜8 mg，锌5 mg，锰10 mg，碘8.5 mg，钴0.10 mg，硒0.02 mg。

Note: The premix provided the following per kg of the diet: vitamin A1350 IU，vitamin D262.5 IU，vitamin E 4 500 IU，Iron 16 mg，Copper 8 mg，Zinc 5 mg，Manganese 10 mg，Iodine 8.5 mg，Cobalt 0.10 mg，Selenium 0.02 mg.

1.3 ANP静脉滴注

将ANP用无菌生理盐水溶解，配制为400 μg/mL的贮存液。试验前称取绵羊空腹体重，按照25 ng/kg BW/min静脉滴注45min[11]计算每只绵羊每天所需ANP的量。吸取相应体积的ANP贮存液以无菌生理盐水稀释成100 mL工作液备用。贮存液和工作液均当日使用当日配制。试验采用自身对照试验设计。试验第1～4天为对照期，第5～8天为试验期。在对照期，每天晨饲前从右颈静脉滴注无菌生理盐水100 mL，控制流速使其在45±5min滴注完毕，滴注开始时即开始晨饲。在试验期，改滴注ANP生理盐水溶液，其他与对照期相同。

1.4 样品采集与处理

试验的第2～4天和6～8天分别于滴注前(即0 min)、滴注开始后第15、30、45、60、90和120 min时分别用氟化钠-草酸钾真空采血管和肝素钠真空采血管从左颈静脉各采集血样5.0 mL左右。血样以3 000 r/m离心10 min分离血浆，将血浆储存于-80 ℃备用。

1.5 测定指标

氟化钠-草酸钾抗凝血浆用于测定血糖(GLU)。肝素钠抗凝血浆用于测定甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、游离脂肪酸(FFA)、乳酸脱氢酶(LDH)、谷草转氨酶(GOT)、谷丙转氨酶(GPT)和尿素氮(BUN)等生理生化指标。FFA测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所，采用7230G分光光度计测定。其他试剂盒购自深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司，采用BS-120全自动生化仪分析测定。

1.6 数据处理与统计分析

静脉滴注合成ANP对阿勒泰羊血液生理生化指标影响的数据分析采用GLM模型进行单响应变量多因素方差分析，数据模型为Xijk=μ+αi+βj+γk+αi×βj+εijk。式中：Xijk为观察值，μ为总体均值，αi(i=1,2)为滴注ANP效应，βj(j=1......7)为采样时间效应，γk(k=1......10)为试验动物效应，αi×βj为滴注与采样时间的交互效应，εijk为误差。

静脉滴注合成ANP后阿勒泰羊血液生理生化指标随时间变化的数据是将相同处理、同一时间点3 d的数据计算算术平均值后采用IBM SPSS 18.0软件包进行配对T检验，显著水平为P<0.05。

2 结果与分析

2.1 静脉滴注ANP对阿勒泰羊血液生理生化指标的影响

将各时间点获得的数据进行三因素(滴注ANP、采样时间、试验动物)单响应变量方差分析，以明确滴注ANP对阿勒泰羊脂肪、蛋白质和糖代谢生理生化指标的影响。从表2可以看出，静脉滴注ANP后，血液中TG水平提高35.71%(P<0.001)，FFA、TC、HDL-C和LDL-水平分别降低25.66%(P<0.001)、12.56%(P<0.001)、17.16%(P<0.001)和16.48%(P<0.001)。

表2 静脉滴注合成ANP对阿勒泰羊血液生理生化指标的影响

注：Trt.处理效应；T.采样时间效应；Trt×T.处理与采样时间的互作相应；A.试验动物效应。

Notes:Trt. treatment effect;T. sampling time effect;Trt×T. the interaction between treatment and sampling time;A. animal effect.

与滴注生理盐水相比，静脉滴注ANP后血糖水平和乳酸脱氢酶的活性分别降低7.83%(P=0.001)和10.37%(P<0.001)。如表2所示，与滴注生理盐水相比，滴注ANP后，血液中GPT和GOT活性降低10.46%(P=0.001)和14.02%(P<0.001)，但对BUN无显著影响(P>0.05)。

2.2 静脉滴注ANP阿勒泰羊血液生理生化指标随时间的变化分析

2.2.1 静脉滴注ANP对血脂的影响 从图1可以看出，静脉滴注ANP后显著提高0(P<0.01)、15(P<0.05)、45(P<0.05)、60(P<0.05)和120 min(P<0.01)时血液中的甘油三酯水平(P<0.05)，第30 min时甘油三酯有升高的趋势(P=0.060)。如图2所示，静脉滴注ANP后，血液中FFA水平均有不同程度的下降，其中第30(P<0.001)、90(P<0.05)和120 min(P<0.05)时静脉滴注ANP后显著降低血液中FFA水平。

从图3可知，除0min外，滴注ANP具有降低血液TC水平的作用，其中第45(P<0.05)、90(P<0.05)和120 min(P<0.01)时达到显著水平。如图4所示，静脉滴注ANP后血液中HDL-C水平分别在第30(P<0.05)、45(P<0.01)、60(P<0.05)和90 min(P<0.05)时显著低于滴注生理盐水期。

图1 滴注ANP对血液中TG水平的影响

图2 滴注ANP对血液中FFA水平的影响

*表示与对照期相比(P<0.05)；**表示与对照期相比(P<0.01)；***表示与对照期相比(P<0.001)。下同。

* means that compared with the control period,(P<0.05); ** means that compared with the control period,(P<0.01);*** means that compared with the control period,(P<0.001).The same below.

从图5可以看出，与生理盐水相比，滴注ANP后，第30、45、60、90和120 min时血液中LDL-C水平均显著低于对照期(P<0.05)。

2.2.2 静脉滴注ANP对血糖水平的影响 滴注ANP对血糖水平的影响见图6。如图6所示，与滴注生理盐水期相比，滴注ANP的0时血糖水平显著升高(P<0.01)，之后在60(P<0.05)和90 min(P<0.05)时血糖水平显著下降。从图7可以看出，滴注ANP后，第0时血液中LDH活性显著提高(P<0.01)，之后在30(P<0.05)、45(P<0.05)、90(P<0.05)和120 min(P<0.001)时血液中的LDH活性显著降低，在第15和60 min时，血液中LDH活性有降低的趋势(P=0.075)。

图3 滴注ANP对血液中TC水平的影响

图4 滴注ANP对血液中HDL-C水平的影响

图5 滴注ANP对血液中LDL-C水平的影响

Fig.5 Intravenous infusion of ANP on blood LDL-C level

2.2.3 静脉滴注ANP对蛋白质代谢的影响 滴注ANP对血液中GPT活性的影响见图8。由图8可知，滴注ANP后在第0和90 min时，血液中GPT分别有升高和降低的趋势(P=0.082和P=0.091)，在第120 min时，血液中GPT显著降低(P<0.05)。由图9可看出，与生理盐水相比，滴注ANP的0时血液中GOT活性显著升高，但是在之后各采样点GOT活性均显著降低(P<0.05)。

图6 滴注ANP对血糖水平的影响

图7 滴注ANP对血液中LDH活性的影响

图8 滴注ANP对血液中GPT活性的影响

滴注ANP对BUN水平的影响见图10。由图10可以看出，在ANP滴注0时，血液中BUN显著升高(P<0.05)，之后的其他采样点均无显著差异。

3 讨 论

3.1 ANP对脂肪代谢的影响

除ANP外，利钠肽还包括BNP、CNP和树眼镜蛇利钠肽(Dendroaspis Natriuretic Peptide，DNP)[1]。利钠肽通过排钠利尿以调节水、电解质平衡，降低后负荷，并能舒张血管。在人类中，以心利钠肽ANP和BNP含量最高[12]。Sengenès等[13]首次发现利钠肽家族中的ANP和BNP具有与异丙肾上腺素相似的促进人腹脂细胞脂解的作用，而CNP的促脂解作用最弱。进一步研究发现，利钠肽家族中DNP的促脂解作用最强，其促脂解强度顺序为DNP>ANP>BNP>>CNP[3]。由于DNP在人体中的含量较低，因此其在脂解中的作用并没有ANP重要。

图9 滴注ANP对血液中GOT活性的影响

图10 滴注ANP对BUN水平的影响

ANP与细胞膜上的受体NPR-A结合促进细胞内第二信使cGMP的产生，继而活化cGMP依赖性蛋白激酶 (PKG)，PKG使脂滴蛋白(perilipin)和激素敏感脂酶(HSL)磷酸化[3]。绵羊也产生利钠肽并存在其受体[7-8]，但它们在脂肪细胞上的分布到目前还未见报道，滴注ANP是否影响绵羊血液脂肪、蛋白质和糖代谢相关指标尚不清楚。

甘油三酯主要在脂肪组织和肝脏中合成。血液中甘油三酯主要来源于食物脂肪的消化吸收和肝脏的合成。机体乳糜微粒和极低密度脂蛋白将甘油三酯运送至肌肉、心脏和脂肪组织加以利用。在本研究中，静脉滴注ANP后血液甘油三酯水平显著升高，可能是ANP降低了组织对甘油三酯利用的结果。甘油三酯在HSL的作用下分解为甘油和FFA，并释放进入血。肾上腺素、去甲肾上腺素和胰高血糖素均可激活HSL。血液中FFA来源于脂肪组织，一般用血浆中脂肪酸的含量来衡量脂肪动员的程度。当人静脉滴注ANP 60 min期间，在滴注15 min后血液中的游离脂肪酸和甘油开始显著增加，到30 min时甘油水平达到最大值，45 min时游离脂肪酸水平达到最大值，在停止滴注20 min后，血液甘油和游离脂肪酸水平恢复到基线值[14]。在本研究中，静脉滴注ANP后，FFA显著下降，是否是加速了细胞对FFA分解利用的结果尚不清楚。研究发现，在肥胖个体中，血液中BNP水平与FFA水平呈负相关，Mizuno等[15]认为这是由于血液这中高水平的FFA会激活过氧化物酶体增殖物激活受体，进而抑制BNP的产生。

3.2 ANP对糖代谢的影响

在本研究中，滴注ANP后血糖水平显著下降。与仅注射胰岛素相比，同时注射胰岛素和ANP可使健康成年男性血糖水平从2.0 mmol/L下降到1.3 mmol/L[16]。ANP通过两种途径降低血糖水平。一是，抑制胰岛素降解。研究发现，ANP在Ⅱ型糖尿病的发生中扮演重要角色。当血液中ANP降低后，通过激活肾素-血管紧张素系统增加机体患糖尿病的风险；增加ANP并不增加胰岛素的分泌，而是抑制胰岛素在肝脏、肾脏和其他器官中的降解[17]。二是，增加细胞对葡萄糖的摄入。Ruiz-Ojeda等[18]研究发现，脂肪细胞在C-ANP4-23的作用下上调葡萄糖转运载体4(glucose transporter 4，GLUT4)、蛋白激酶、磷酸腺苷活化的蛋白激酶基因的表达，使细胞摄入葡萄糖的速度增加2倍，细胞内cAMP显著增加。在本研究中，滴注ANP后，LDH活性显著下降。这与ANP改变碳水化合物代谢有关。滴注ANP使骨骼肌中的乳酸增加25%，丙酮酸增加530%，乳酸/丙酮酸比从103降低到24。这种变化可能是由于游离脂肪酸抑制了丙酮酸脱氢酶活性的结果[19]。骨骼肌中过高的丙酮酸可促进糖的分解代谢，过高的乳酸可能抑制乳酸脱氢酶活性。

3.3 ANP对蛋白质代谢的影响

ANP对蛋白质代谢有何影响尚未见报道。在本研究中，滴注ANP后，绵羊血液中GOT和GPT活性显著下降，但BUN无显著变化，这可能是ANP通过降低转氨酶活性、抑制蛋白质分解的结果。当绵羊滴注ANP后，血液中ANP、去甲肾上腺素、皮质醇和cGMP显著提高，促肾上腺皮质激素和精氨酸加压素有少量增加，而醛固酮水平下降[20-21]。众所周知，儿茶酚胺类激素通过β-肾上腺素能受体和环磷酸腺苷依赖途径的介导，抑制骨骼肌中依Ca2+的蛋白质降解；同时，去甲肾上腺素可增加蛋白质的合成，导致蛋白质的沉积增加[22]。

4 结 论

对绵羊静脉滴注25 ng/kg BW/min 45 min，可提高血液中甘油三酯浓度，降低游离脂肪酸、胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇和血糖浓度以及乳酸脱氢酶、谷丙转氨酶和谷草转氨酶活性，但不改变血液中尿素氮浓度。