日粮中添加NCG对妊娠前期鄂尔多斯细毛羊子宫内膜层及胎儿发育的影响

吴宝升，张崇志△，桑 丹，李胜利，张春华，金 鹿，斯登丹巴，谷 英，孙海洲*

(1. 内蒙古自治区农牧业科学院，内蒙古 呼和浩特 010031；2. 鄂尔多斯市农牧业科学研究院，内蒙古 鄂尔多斯 017000)

日粮营养水平对妊娠期母体内营养物质的合成和代谢改变起着至关重要作用，妊娠期营养不良导致母体动员自身的营养物质以确保胎儿正常的生长发育。然而，当母体所提供的营养物质无法满足胎儿正常的生长发育时，将会导致胎儿宫内生长受限(IUGR)[1]。IUGR不仅影响动物初生重，阻碍胎儿生长发育，而且与出生后的高发病率和死亡率密切相关，造成家畜养殖业的巨大损失[1]。

Wu等[2]研究发现，IUGR和胚胎损失是在人和其他哺乳动物中的突出问题。在养羊业中，由胚胎或胎儿死亡导致的经济损失非常大，胚胎或胎儿死亡数量约占30%[3]，其中在母羊妊娠期18 d至分娩阶段胎儿死亡损失率约占9.4%[4]。母羊胚胎或胎儿死亡主要发生在妊娠早期识别、受精卵附植、胎盘的发育等关键窗口期[5]，其中妊娠早期的受精卵在子宫内附植和胎盘形成与生长发育是胎儿程序化发育的关键时期，此阶段对繁殖母羊受胎率和胎儿生长发育的影响非常大。N-氨甲酰谷氨酸(NCG)作为内源精氨酸生成激活剂，能够通过促进谷氨酰胺或脯氨酸合成瓜氨酸，进而促进内源性精氨酸的合成，日粮添加NCG不仅可有效促进内源精氨酸合成，达到调控动物生长及营养分配的作用，也能有效降低繁殖母畜胚胎损失、提高胎儿出生重及母畜繁成率[6-9]。谷氨酰胺和精氨酸在母畜妊娠期的胚胎、胎盘和胎儿生长发育过程中具有重要作用，能够通过AMPK、cGMP和mTOR等信号通路来调节底物氧化和蛋白质合成[6]。

目前，国内外关于NCG对母羊妊娠前期营养调控方面的研究甚少，因此，本试验在日粮中添加不同剂量的NCG，研究NCG对妊娠前期鄂尔多斯细毛羊子宫内膜层及胎儿发育的影响，为鄂尔多斯细毛羊妊娠期繁殖性能的提高提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物

选择体况良好，2～3周岁，平均体重为(50.62±0.52)kg的受孕鄂尔多斯细毛羊母羊40只随机分为3组：试验组13只，试验2组13只，对照组14只。各组试验母羊体重经t检验差异均不显著(P>0.05)。试验于鄂尔多斯细毛羊妊娠期开始至妊娠期第90 d结束，整个试验期90 d。

1.2 试验动物的饲养管理

饲喂NRC(2007)推荐的基础日粮(满足妊娠双胎母羊需要量为26.2 g/kg体重)，再与不同浓度NCG进行混匀，每只母羊单独套袋饲喂，准确记录供给饲喂量和剩料量。日粮的营养组成及营养水平见表1。40只试验母羊随机分为3组，NCG1组饲喂基础日粮+0.30 g NCG/d(n=13),NCG2组饲喂基础日粮+0.40 g NCG/d(n=13)，对照组饲喂基础日粮(n=14)。每日上午8:00和下午17:00饲喂两次，自由饮水。NCG添加剂量参考李金霞[10]前期的试验结果。每天清扫羊圈、清除粪便、清洗饮水池，确保周围环境的清洁。

1.3 取样方法

妊娠期第0 d、45 d和90 d，对试验母羊进行称重，根据体重变化及时调整母羊的日粮供给量。在妊娠期第45 d和90 d，分别每组3只母羊进行屠宰，立即取出子宫、剥离尿囊绒膜和羊膜，用50 ml注射器抽取尿囊液和羊水并测量体积。记录胎盘及附属物重、胎儿体重、体高、体长、心脏、肺脏、肝脏、脾脏、胰腺、肾脏及肾周围脂肪重；妊娠期第17 d，每组3只母羊进行屠宰采集子宫内膜；妊娠期第90 d，采集肾脂肪组织，保存-80 ℃冰箱待测。

1.4 基因mRNA表达量的测定

采用实时荧光定量PCR方法测定子宫内膜及肾脂肪组织中相关基因的mRNA表达量。根据由GenBank中公布的序列利用Primer5.0设计特异性引物，绵羊子宫内膜及肾脂肪组织中相关基因：骨桥蛋白(osteopontin,OPN)、整合素αvβ3(alpha v beta 3 integrin,Integrinαvβ3)、骨形态发生蛋白7(bone morphogenetic protein7,BMP7)、过氧物酶体增殖激活受体γ辅激活因子1(peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator-1 alpha,PGC-1α)、PR结构域蛋白16(PR domain-containing 16,PRDM16)、解偶联蛋白(uncoupling protein 1,UCP-1)由大连宝生物工程有限公司合成并验证，β-actin作为内参基因，引物信息见表2。从-80 ℃冰箱中取出子宫内膜及肾脂肪组织，分别剪取0.5 g 左右，用RNA isoPlus 提取总RNA，利用紫外分光光度计测定光密度(OD值)，计算OD260/280和OD260/230。用反转录试剂盒(大连TaKaRa公司，PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser)反转录mRNA 为cDNA，使用荧光定量PCR仪(illumina Eco)SYBRGreen 法检测mRNA的表达量，参数设置：95 ℃预变性2 min，95 ℃变性15 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，40个循环。

表1 日粮组成及营养水平

注：①每千克预混料成分：Fe(FeSO4·7H2O)170 g；Cu(Cu SO4·5H2O)70 g；Mn(MnSO4·5H2O)290 g；Zn(ZnSO4·7H2O)240 g；Co(CoCl2·6H2O)510 mg；KI 200 mg；NaSeO3130 mg；VA1620 000 IU；VD3324 000 IU；VE 540 IU；VK3150 mg；VB120.9 mg；VB5450 mg；泛酸钙 750 mg；叶酸 15 mg。

Note：①Composition of per kg of the premix：Fe(FeSO4·7H2O)170 g；Cu(Cu SO4·5H2O)70 g；Mn(MnSO4·5H2O)290 g；Zn(ZnSO4·7H2O)240 g；Co(CoCl2·6H2O)510 mg；KI 200 mg；NaSeO3130 mg；VA1620 000 IU；VD3324 000 IU；VE 540 IU；VK3150 mg；VB120.9 mg；VB5450 mg；Calcium pantothenate 750 mg；folic acid 15 mg.

表2 引物信息表

1.5 数据分析

所有数据采用SAS9.0一般线性模型统计分析，Duncan法进行多重比较，结果以平均值±SEM表示。

2 结果与分析

2.1 NCG对母羊体重及妊娠相关器官的影响

由表3可知，妊娠期第0 d和45 d，对照组、NCG1组和NCG2组母羊体重没有显著差异；妊娠期第90 d，NCG2组母羊体重最高，达到61 kg，但与对照组和NCG1组母羊体重差异不显著。由表4可知，妊娠期第45 d和90 d，NCG2组和NCG1组母羊羊水和尿囊液含量高于对照组，但差异不显著；妊娠期第45 d，NCG2组母羊胎盘及附属物重高于对照组和NCG1组，妊娠期第90 d，对照组母羊胎盘及附属物重高于NCG2组和NCG1组(P>0.05)。

表3 妊娠前期母羊体重变化情况

注：同行数据肩注相同字母表示差异不显著(P>0.05)，相邻字母表示差异显著(P<0.05)，相隔字母表示差异极显著(P<0.01)。下同。

Note: In the same row, values with the same letter superscripts mean insignificant difference (P>0.05), adjacent letter superscripts mean significant difference (P<0.05), and separate letter superscripts mean extremely significant difference (P<0.01)．The same below.

表4 日粮中添加不同剂量的NCG对母体羊水、尿囊液和胎盘及其附属物重的影响

2.2 NCG对胎儿体重、体尺及各器官重的影响

由表5可知，妊娠期第90 d，NCG1组胎儿的肺脏显著高于对照组，NCG2组胎儿的肝脏显著高于对照组(P<0.05)。

2.3 NCG对母羊子宫内膜及胎儿肾脂肪组织相关基因表达量的影响

由表6可知，妊娠期第17 d，NCG1组母羊子宫内膜OPN基因表达显著高于NCG2组(P<0.05)和对照组(P<0.01)，NCG2组母羊子宫内膜Integrinαvβ3基因表达高于NCG1组(P>0.05)、显著高于对照组(P<0.05)。

表5 日粮中添加不同剂量的NCG对胎儿体重、体尺和器官重的影响

表6 妊娠期17 d母羊子宫内膜层相关基因表达量的变化

由表7可知，妊娠期第90 d，NCG1组(P<0.01)和NCG2组(P>0.05)胎儿肾脂肪PGC-1α基因表达量低于对照组，NCG2组(P<0.01)和NCG1组(P>0.05)胎儿肾脂肪PRDM16基因表达量低于对照组；而NCG2组和NCG1组胎儿肾脂肪BMP7基因(P<0.05)和UCP-1基因(P<0.01)表达量显著高于对照组。

表7 妊娠期90天胎儿肾脂肪相关基因表达量的变化

3 讨 论

3.1 NCG对母羊体重及妊娠相关器官的影响

绵羊的妊娠期长度平均为147 d，其中胎儿和胎盘的生长发育时间不同，孕体发育过程中母体代谢程序化与胎儿发育程序化之间息息相关[11-12]。母羊妊娠期前50 d是胚胎形成、胎儿器官生成和增生阶段，此时胚胎和孕体营养需要量较少，但是胎儿的代谢率和生长率都很高；妊娠期第50～90 d是胎盘生长的最快阶段，妊娠期第80 d胎盘生长达到最大值，其结构和功能发生较大变化以增强自身的容量、营养素和气体的转运能力[13-14]。Kim等[15]研究发现，精氨酸对母畜妊娠期的胚胎、胎盘和胎儿生长发育过程中具有重要作用。在本试验中，妊娠前期(0～90 d)日粮添加不同剂量的NCG对鄂尔多斯细毛羊体重、胎盘及其附属物重没有显著的影响(P>0.05)，然而，日粮添加不同剂量的NCG在妊娠期45 d和90 d都有增加羊水和尿囊液含量的趋势(P>0.05)， 这可能由于日粮中NCG的添加改变了羊水和尿囊液中的物质代谢反应[16]。

3.2 NCG对胎儿体重、体尺及各器官重的影响

胎儿或胚胎死亡主要发生在妊娠期前18 d的妊娠识别和受精卵着床期，妊娠早期母畜补充0.4% NCG可以有效促进黄体形成，降低胚胎死亡率[17]。本试验结果发现，妊娠前期(0～90 d)日粮添加不同剂量的NCG有效促进鄂尔多斯细毛羊胎儿的生长和发育，胎儿体重、体长、体高、心脏、脾脏、肾脏、胰腺、肾周围脂肪均表现为增加的趋势(P>0.05)，其中NCG1组胎儿肺脏重和NCG2组胎儿肝脏重显著高于对照组(P<0.05)。在妊娠前期，胎儿肝脏重的增加能够提高机体代谢活动并促进糖异生途径，使胎儿对葡萄糖的利用率最大化，同时，胎儿的肝脏和肾脏可以提供更多的葡萄糖来维持自身生长和发育[18]。也有研究发现，妊娠前期母体营养对胎儿肾脏、肺脏和肝脏等较晚成熟的器官发育的具有重要影响，这与本试验的研究结果相似[19]。

3.3 NCG对母羊子宫内膜相关基因表达量的影响

在胚胎移植试验中发现，孕体必须在发情周期的12或13 d内移植到子宫，目的是让母体能够在胚胎移植之后获得怀孕成功，在孕体移除的母羊怀孕前13 d的发情周期不变，然而移除那刻起对黄体寿命延长到了17 d[20]。母羊妊娠识别开始于妊娠期第12～13 d，胚胎在子宫内的附植是在妊娠期第17～20 d，胚胎附植的过程是极其复杂的，不仅需要P4和IFNT等一系列激素，还需要Integrin αvβ3、OPN等蛋白的潜在调控作用。OPN 及其受体Integrinαvβ3可能是启动胚胎附植级联反应的主要因子，在调节胚胎发育、附植及分化等方面起着重要作用[21]。胚胎的附植、胎盘形成和胎儿胎盘生长发育需要孕体通过妊娠识别信号来维持和建立稳定的子宫内环境，以维持黄体分泌孕酮的功能[22]。 Kim等[23]研究发现，绵羊滋养外胚层细胞中Integrin与OPN相结合的现象，OPN结合受体Integrinαvβ3通过激活滋养外胚层细胞的黏附、迁移和细胞骨架重塑相关信号通路，使孕体的增殖和延伸拉长以及植入顺利完成胚胎的附植。也有研究发现，在怀孕女性的子宫内发现受体Integrinαvβ3的表达，当改变其表达后女性出现不孕症，此阶段为胚胎植入窗口期[24-25]。最初孕体在子宫-胎盘表面附着和植入的时候需要胚胎植入窗口期的Integrinαvβ3与OPN相互密切结合。本试验中，妊娠前期日粮添加不同剂量的NCG显著提高了母羊子宫内膜层OPN和Integrinαvβ3的mRNA表达量(P<0.05)，说明日粮中添加不同剂量的NCG能够促进OPN和Integrinαvβ3在子宫内膜层的表达，OPN和Integrinαvβ3主要通过激活mTOR信号刺激孕体的迁移、增生和发育[23]。

3.4 NCG对胎儿肾脂肪组织相关基因表达量的影响

饥饿和寒冷环境是羔羊死亡的主要因素，初生羔羊死亡最主要是体温过低造成的[26]。动物肾脏周围的褐色脂肪组织(brown adipose tissue, BAT)能够通过氧化脂肪酸来产热，在寒冷环境中维持体温，为新生羔羊提供代谢产热的脂肪，有效确保羔羊适应子宫外环境的挑战和预防体温过低症状[27]。在新生羔羊体内，BAT大约占整个脂肪组织的80%，妊娠前期羔羊体内BAT迅速贮存，出生时沉积速度降低[27]，约占出生体重的2%。BAT能够以非颤抖性产热方式提供新生羔羊约50%的热量[28]，所以增加胎儿BAT沉积对潜在提高新生儿产热机制和生存能力具有重要作用[29]。研究发现，妊娠前期增加母体营养能够促进胎儿BAT的生长和发育，BAT通过UCP-1快速地为新生儿释放热量，增强子宫外环境的适应能力，提高出生羔羊的存活率[30]。也有研究发现，精氨酸促进棕色的蛋白质合成和细胞生长脂肪细胞前体细胞是通过mTOR信号通路实现的[31]，在妊娠第100～140 d母体灌注精氨酸能增加胎儿肾脏周围BAT沉积[32]。作为BAT线粒体内膜上的一种组织特异性很高的UCP-1能够引起线粒体氧化呼吸的电子传递和ATP产生偶联作用，以降低脂肪酸氧化代谢的产能效率，大量能量以热能的形式散发，经过BAT丰富的血管被输送到动物机体各个部分[33]。本试验结果发现，妊娠前期日粮添加不同剂量的NCG显著提高了胎儿肾周围BAT中UCP-1(P<0.01)和BMP7(P<0.05)的mRNA表达量。BMP7在BAT细胞分化过程中发挥着重要作用，BMP7能够强烈激活p38MAPkinase 和下游的ATF-2，并通过PGC-1α来激活UCP-1的表达，线粒体的生成[34]。然而，NCG2组胎儿肾周围BAT中PRDM16(P<0.01)和NCG1组胎儿肾周围BAT中PGC-1α(P<0.01)的mRNA表达量显著降低。研究发现，缺乏PGC-1α的动物体内BAT形态变化很小，但UCP-1表达量偏低，对冷刺激敏感[35]。通过BAT体外培养发现，PGC-1α的表达不会影响BAT的形成，只会影响产热功能，所以说，PGC-1α是调控适应性产热的主要分子，并不是BAT形成的决定性分子[33]。等于或者低于生理水平的PRDM16能够促进BAT细胞的形成，但PRDM16的缺失会阻碍BAT细胞的分化，过表达可显著增加BAT细胞的数量[36]。本试验条件下，NCG1组和NCG2组高表达的UCP-1(P<0.01)和BMP7(P<0.05)、以及低表达的PRDM16是促进鄂尔多斯细毛羊胎儿肾周围BAT沉积的关键基因，BAT沉积还受到其他诸多因子的一系列的调控，调控BAT细胞形成的信号也不确定，其调控机制还有待于进一步研究。

4 结 论

在本试验条件下，妊娠前期日粮中添加NCG有效促进了鄂尔多斯细毛羊妊娠识别、早期胚胎定植和子宫内膜层发育，保障了胎儿早期程序化生长。