压榨法制备牡丹籽油的α-亚麻酸含量检测与抗氧化研究

葛云龙 赵修华 祖元刚 袁安龙

(1.东北林业大学森林植物生态学教育部重点实验室，哈尔滨 150040； 2.哈尔滨职业技术学院医学院，哈尔滨 150040； 3.厦门涌泉集团有限公司，厦门 361023)

牡丹(PaeoniasuffruticosaAndr.)是毛茛科(Ranuncu aceae)芍药属(Paeonia)植物，也有学者认为应当从毛茛科中分出单独成立芍药科(Paeoniaceae)，芍药属(Paeonia)牡丹组(Sect Moutan)[1]，又被称为鹿韭、白术、木芍药，学名为牡丹，为多年生落叶灌木[2]，目前我国牡丹种植范围广阔，主要种植范围分布在安徽铜陵、河南洛阳、四川、陕西汉中、山东菏泽、河北柏山、浙江、甘肃等地；其中河南洛阳、安徽、山东菏泽种植最多，据统计，2015年山东菏泽地区预计牡丹种植面积已达到6.67万平方米[3]。牡丹自古以来就开始栽培，历史悠久，也是我国固有的名花，经研究发现牡丹的根、茎、叶、花、花粉、籽均具有很高的食药价值和经济价值，可见牡丹全身是宝[4]。人们常将其分为观赏牡丹和油用牡丹，油用牡丹也可用作中药材使用，也是丹皮酚的主要来源，其中观赏牡丹主要分布在河南洛阳和山东菏泽，主要是用于园林景区、观赏花卉等；而油用牡丹以安徽铜陵的凤丹最为著名，主要是以凤丹牡丹品系为主。其牡丹籽主要用于压榨牡丹籽油，具有较高的观赏价值、药用价值和食疗保健价值。

牡丹籽油因其营养丰富而独特，又有医疗保健作用，被有关专家称为是“植物油中的珍品”，也被人称为“液体黄金”，是中国独有的健康保健食用油脂[5]。牡丹籽油含丰富的不饱和脂肪酸，高达90%以上，不饱和脂肪酸主要为α-亚麻酸(含量超过40%，是橄榄油的140倍)、亚油酸、油酸；饱和脂肪酸主要为棕榈酸和硬脂酸[6]；α-亚麻酸是构成细胞膜和生物酶的基础物质，是人体健康必需脂肪酸，但是人体内不能自己合成，需要利用外界食物补充，因此是一种普遍缺乏必需营养素[7～8]。它可以人体多种酶的催化作用下，到达身体各处，最后通过肝脏代谢功能，转化为人体必需的生命活性因子DHA(二十二碳六烯酸)和EPA(二十碳五烯酸)[9]。DHA是大脑、视网膜等神经系统膜磷脂的重要组成部分，因此对儿童的大脑发育、智力开发和视力发育起至关作用；EPA是合成体内白三烯和前列腺素的前体。人体一旦外界食物摄取不足时，缺乏这种营养元素，会导致智力迟缓、视力减弱、免疫力下降、疲劳健忘、动脉粥样硬化等并发症状的发生[10]。因此α-亚麻酸具有很高的保健、医用价值。

我国在2011年3月22日，由卫生部《卫生部关于批准元宝枫籽油和牡丹籽油作为新资源食品公告》(2011年第9号)批准牡丹籽油为新资源食品[11]；2014年国家食品药品监督管理总局，将牡丹籽油原料列为可用化妆品目录，标志着牡丹籽油可以正式进入食用油、化妆品原料市场[12]。牡丹籽油的提取方法主要有物理压榨法、有机溶剂浸出法、超临界CO2萃取法、亚临界萃取法等，其中有机溶剂浸出法会存在有机溶剂的残留情况，超临界CO2萃取法设备成本高、生成能力低，亚临界萃取法会有丁烷残留等缺点，而物理压榨法是利用外界压力直接将牡丹籽中油脂分离出来，压榨过程中无化学溶剂残留，具有安全、卫生、无污染、营养成分不破坏等优点。本研究主要利用物理压榨法制备牡丹籽油，并利用气相色谱检测牡丹籽油中α-亚麻酸含量和牡丹籽油对清除DPPH自由基、ABTS自由基、Fe2+的还原以及清除-OH自由基的能力等进行体外抗氧化性能的研究。

1 实验仪器与材料

1.1 仪器

CBS-95型螺旋压榨榨油机(长春长白山牌榨油机)；7890A型气相色谱仪(美国Agilent公司)；紫外分光光度计(上海奥析科学仪器有限公司)；DENVER型电子分析天平(美国丹佛仪器公司)；水浴锅(上海辽卓科贸有限公司)；涡旋振荡器(常州市金坛晨阳电子仪器厂)。

1.2 材料

牡丹籽(山东菏泽)；市售牡丹籽调和油(产地陕西)；正己烷(天津市富于精细化工有限公司，分析纯)；浓硫酸(北京化工厂有限公司，分析纯)；无水乙醇(天津市天力化学试剂有限公司，分析纯)；甲醇(山东禹王实业有限公司)；乙酸乙酯(天津市富于精细化工有限公司，分析纯)；铁氰化钾(天津中津化工有限公司，分析纯)；三氯乙酸(天津市富于精细化工有限公司，分析纯)；三氯化铁(天津市致远化学试剂有限公司，分析纯)；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(英文缩写DPPH，德国Sigma)；2，2′-联氮-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(英文缩写ABTS，Solarbio)；水杨酸(上海源叶生物科技有限公司)。

2 牡丹籽油的制备

将牡丹籽原料进行筛分、脱壳处理。检测脱壳的牡丹籽含水率，确定微波干燥输送带的运行速度。进行微波干燥，牡丹籽仁表面温度在75℃左右为正常温度，干燥后水分在7%～8%为宜。将干燥后的牡丹籽仁进入螺旋榨油机中进行第一遍压榨牡丹籽油，螺旋挤压的籽粕经粉碎直接进入旋榨油机中进行二次压榨，收集两次压榨的牡丹籽油，最后得到的牡丹籽油和残渣混合液体，再进行离心(5 000 r·min-1，20 min)，上清液即为牡丹籽油。

3 牡丹籽检测方法

3.1 α-亚麻酸含量检测

气相色谱参数设置如下：气相色谱柱型号：DB-WAX毛细管柱，长30 m，孔径230 mm，初始柱温保持在150℃下保持1 min，之后以10℃·min-1的速度升温到230℃，保持此温度20 min；进样针和检测器的温度分别为200℃和280℃，氢气和空气的流速分别为40和400 mL·min-1，氮气作为载气其流速为25 mL·min-1，分流比为20∶1。

气相色谱样品制备：精确吸取100 μL制备好的牡丹籽油，加入10 mL正己烷，充分混匀，再加入2% H2SO4—甲醇溶液，搅拌均匀，80℃下反应30 min(或者常温反应2 h)进行甲酯化反应，反应结束后加入10 mL去离子水，摇匀后静止20 min，取上清液进行气相检测，进样6 μL。

3.2 抗氧化性检测

3.2.1 清除DPPH自由基

样品制备：分别取牡丹籽油和牡丹籽调和油各5 g于2个50 mL容量瓶中，用乙酸乙酯：水混合液(1∶2)定容至50 mL，为100 mg·mL-1样品液，梯度稀释至90、80、70、60、50、40、30、20、10 mg·mL-1待用。

试剂准备：精确称取DPPH 0.005 8 g于烧杯中加入100 mL乙醇充分溶解，避光保存，现用现配。

检测：取上述待测液1.5 mL加入1.5 mL DPPH检测液，混合均匀。室温避光静置30 min。于517 nm处测吸光值。计算公式如下：

DPPH自由基清除率=(A0-A)/A0×100

(1)

式中：A0代表1.5 mL混合液加入1.5 mL DPPH检测液的吸光值；A代表1.5 mL样品加入1.5 mL DPPH检测液的吸光值。

3.2.2 清除ABTS自由基

样品制备：分别取牡丹籽油和牡丹籽调和油各5 g于2个50 mL容量瓶中，用乙酸乙酯∶水混合液(1∶2)定容至50 mL，为100 mg·mL-1样品液，梯度稀释至0.10、0.08、0.06、0.04、0.02、0.01 mg·mL-1待用。

试剂准备：精确称取ABTS药品0.1920 g加入50 mL甲醇，混合溶解；在称取0.0946 g过硫酸钾加入50 mL去离子水中混合溶解；然后两者混合均匀，避光静置12～16 h。用时取适量，用乙醇稀释，吸光值为0.7±0.002。

检测：取上述待测液0.5 mL加入3 mL ABTS检测液，混合均匀。室温避光静置30 min，于734 nm处测吸光值。计算公式如下：

ABTS自由基清除率=(A0-A)/A0×100

(2)

式中：A0代表0.5 mL混合液加入3 mL ABTS检测液的吸光值；A代表0.5 mL样品加入3 mL ABTS检测液的吸光值。

3.2.3 Fe2+还原力

样品制备：分别取牡丹籽油和牡丹籽调和油各5 g于2个50 mL容量瓶中，用乙酸乙酯∶水混合液(1∶2)定容至50 mL，为100 mg·mL-1样品液，梯度稀释至90、80、70、60、50、40、30、20、10 mg·mL-1待用。

试剂准备：配置0.2 mol·mL-1、pH6.6磷酸缓冲液(3.56 g Na2HPO4·2H2O加超纯水定容至100 mL)，取62.5 mL；称取7.16 g Na2HPO4·12H2O加超纯水定容至100 mL，取37.5 mL；两者混合均匀，为磷酸缓冲液；配置1%铁氰化钾：称取1 g铁氰化钾加超纯水定至100 g；10% TCA：称取10 g TCA加超纯水至100 g；0.1% FeCl3：称取0.1 g FeCl3加超纯水至100 g。

检测：1 mL磷酸缓冲液加入1 mL 1%铁氰化钾再加入2 mL样品，混匀。50℃保温20 min，加入1 mL 10% TCA，混匀，离心10 min。取上清2 mL再加入1 mL超纯水和0.4 mL 0.1% FeCl3，混匀，静置10 min，于700 nm处测吸光值。吸光值越大，还原力越强。

3.2.4 清除羟(-OH)自由基

样品制备：分别取牡丹籽油和牡丹籽调和油各5 g于2个50 mL容量瓶中，用乙酸乙酯∶水混合液(1∶2)定容至50 mL，为100 mg·mL-1样品液，梯度稀释至25、20、15、10、5 mg·mL-1待用。

试剂准备：精确配置6 mmol·L-1水杨酸、6 mmol·L-1FeSO4以及8 mmol·L-1H2O2(H2O20.91 g加入乙醇100 mL)，现用现配。

检测：在37℃环境下，1 mL样品加入1 mL 6 mmol·L-1水杨酸和0.5 mL 6 mmol·L-1FeSO4，混匀后加入1 mL 8 mmol·L-1H2O2，37℃水浴15 min，于510 nm处测吸光值。计算公式：

-OH清除率=(A3-(A1-A2)/A3)×100%

(3)

式中：A1代表1 mL样品加入1 mL 6 mmol·L-1水杨酸、0.5 mL 6 mmol·L-1FeSO4和1 mL 8 mmol H2O2；A2代表1 mL样品加入1 mL 6 mmol·L-1水杨酸、0.5 mL 6 mmol·L-1FeSO4和1 mL乙醇；A3代表1 mL混合液加入1 mL 6 mmol·L-1水杨酸、0.5 mL 6 mmol·L-1FeSO4和1 mL 8mmol·L-1H2O2。

图1 牡丹籽油气相色谱图Fig.1 GC of peony seed oil

图2 牡丹籽调和油油气相色谱图Fig.2 GC of peony seed harmonized oil

4 牡丹籽油检测结果

4.1 α-亚麻酸含量检测结果

本实验提供两种牡丹籽油进行α-亚麻酸(ALA)含量检测，即为牡丹籽油(实验室压榨)、牡丹籽调和油(市售)。经气相色谱检测如图1～2可知，实验室压榨牡丹籽油中α-亚麻酸含量为43.12%、而牡丹籽调和油(市售)α-亚麻酸含量为29.99%。

图3 不同浓度样品的DPPH自由基清除率Fig.3 DPPH free radical scavenging rate of the samples with different concentrations

图4 不同浓度样品的ABTS自由基清除率Fig.4 ABTS radical scavenging rate of the samples with different concentrations

4.2 抗氧化性检测结果

4.2.1 清除DPPH自由基能力

DPPH是一种稳定的有机自由基，对DPPH自由基的清除能力可作为抗氧化活性评价的一项重要指标。如图3所示，随着两种牡丹籽油的浓度从10 mg·mL-1增加到80 mg·mL-1，两种牡丹籽油清除DPPH自由基能力逐渐增大；可以看出牡丹籽油清除率最强，在80 mg·mL-1时，牡丹籽油清除率达到了47.48%，牡丹籽调和油清除率达到36.80%，是牡丹籽调和油的1.29倍。所以牡丹籽油具有更高的抗氧化力。

4.2.2 清除ABTS自由基能力

清除ABTS自由基能力是另一种考察抗氧化性的方法。如图4所示，随着两种牡丹籽油的浓度从10 mg·mL-1增加到80 mg·mL-1，两种牡丹籽油清除ABTS自由基能力逐渐增大；可以看出牡丹籽油的清除率最强，在80 mg·mL-1时，牡丹籽油清除率达到69.79%，牡丹籽调和油清除率达到46.15%，是牡丹籽调和油的1.51倍。证明了牡丹籽油具有更强的清除ABTS自由基能力，再次验证DPPH的结果。

图5 不同浓度样品的Fe2+还原力Fig.5 Fe2+ reducing power of the samples with different concentrations

图6 不同浓度样品的-OH自由基清除率Fig.6 -OH radical scavenging rate the samples with different concentrations

4.2.3 Fe2+还原力分析

牡丹籽油和牡丹籽调和油的Fe2+还原力曲线如图5所示，通过对铁氰化钾的还原能力分析，样品浓度从0.01 mg·mL-1增加到0.1 mg·mL-1，两种牡丹籽油的对Fe2+还原能力均逐渐增强。当浓度达到0.1 mg·mL-1时，两种牡丹籽油的还原力都达到了最高，牡丹籽油的吸光度为1.05，牡丹籽调和油吸光度为0.29。以普鲁士蓝的总生成量为指标，对比两种牡丹籽油样品在700 nm处的吸光度，牡丹籽油的还原力明显高于调和油，在0.1 mg·mL-1时的还原值是调和油的3.62倍。还原力测定结果与清除DPPH、ABTS自由基能力测定的结果一致。

4.2.4 清除-OH自由基能力

羟基自由基清除率是反应油脂抗氧化作用的重要指标。-OH是人体内最活泼，是多数氧自由基的母体，可衍生出多种自由基，也是毒性最大的自由基，它直接损伤各种生物大分子、生物膜以及细胞膜及细胞DNA[13]，导致多种疾病的发生和机体衰老[14]。通过Fenton反应体系测定富集牡丹籽油、自制牡丹籽油和市售牡丹籽油的羟自由基(-OH)清除率，本试验通过测定了不同质量浓度的两种牡丹籽油进行清除-OH能力测定，其结果见图6所示，随着两种牡丹籽油的浓度从5 mg·mL-1增加到25 mg·mL-1，两种牡丹籽油清除-OH自由基能力逐渐增大；可以看出牡丹籽油的清除率最强，在25 mg·mL-1时，牡丹籽油的清除率64.35%，牡丹籽调和油清除率达到44.57%，是调和油的1.44倍。证明了牡丹籽油具有更强的清除-OH自由基能力，再次验证DPPH、ABTS的结果。

5 讨论

通过对两种牡丹籽油α-亚麻酸含量检测结果可知，牡丹籽油中α-亚麻酸含量为43.12%、而牡丹籽调和油α-亚麻酸含量只有29.99%。通过对两种牡丹籽油的清除DPPH、ABTS、Fe2+还原力以及清除羟自由基的能力的实验对比，两种牡丹籽油都具有一定的抗氧化功能，强弱顺序为：牡丹籽油>牡丹籽调和油。清除DPPH自由基能力牡丹籽油是调和油的1.29倍；清除ABTS自由基能力牡丹籽油是调和油的1.51倍；对Fe2+还原能力牡丹籽油是调和油的3.62倍；清除-OH自由基能力牡丹籽油是调和油的1.44倍。因牡丹籽油中本身具有很高的α-亚麻酸含量，具有一定的抗氧化功能，而牡丹籽调和油经检测得知α-亚麻酸的含量只有29.99%，因此抗氧化性能减弱。因此，通过本实验得知牡丹籽油的体外抗氧化能力较强，这对牡丹籽油的研发具有重要参考意义。