阴阳离子表面活性剂对无花果叶中有效成分提取工艺优化及初步功能评价

孟 瑶 余 莲 秦祥宇 刘 畅 王泽霖 赵春建 付玉杰*

(1.东北林业大学森林植物生态学教育部重点实验室，哈尔滨 150040； 2.东北林业大学林业生物制剂教育部工程研究中心，哈尔滨 150040； 3.东北林业大学化学化工与资源利用学院，哈尔滨 150040)

无花果(FicuscaricaL.)英文名为fig，外观只见果不见花所以在民间称之为无花果。虽然其果实备受食品市场的欢迎，但其叶子通常作为果实加工的副产品而丢弃处理，在产生大量的生物质资源浪费的同时也因为不恰当的处理对环境造成了一定的影响。无花果叶具有多重药理活性，包括抗氧化[1]，抗菌，抗肿瘤[2]，抗虫[3]，抗病毒以及降血糖降血脂[4～5]等，在医疗及农业等领域具有较大的开发潜能。无花果叶中含有丰富的天然活性物质[6]，所以开发出一种高效的提取无花果叶中有效物质的方法是十分必要的。

中草药中有效物质提取的一种新兴手段——微波辅助提取技术，是通过使用适当的溶剂在微波反应器中从天然植物、矿物或动物组织中获取目标产物的技术和方法[7]。微波辅助提取法具有快速高效，加热均匀[8]等优点，同时由于微波设备操作简单，且节省溶剂和提取所用时间，所有参数均可以数据化，能够与制药现代化接轨[9]，在提取过程中温度较低，不易糊化[10～11]，后续的处理也十分方便。经上述可得，微波辅助提取工艺提取效率高，在化工生产中具有广阔的应用前景。

传统的有机试剂在天然产物的提取中占主导地位，但是能耗大，产率低是其亟需解决的问题。表面活性剂由于具有两亲性，在提取极性较小的目标产物后还可以充分溶解在极性较大的水溶液中，这是其他提取剂所不能比较的[12]。目前，表面活性剂在天然产物提取上的应用还处于初步阶段，但是由于其提取效率高，短时间内能提取完全，且用量较低，综合经济效益高等优点受到了越来越多的关注。同时，因为其还具有良好的复配性质[13]，可作为一种新型的环保绿色可替代的提取剂[14～15]。本实验采用了阴阳离子表面活性剂进行复配，更好地对无花果叶中的不同化合物进行捕捉，联合微波辅助对无花果叶中的有效成分进行提取，通过单因素法对最佳的提取工艺进行了研究，本方法操作简单且溶剂用量较少，同时也能有效地提高最终粗提物的品质，为天然产物的开发利用提供了必要的科学依据与实验参考。

1 材料与方法

1.1 原料与试剂

无花果叶采摘在山东省威海市；十二烷基三甲基溴化铵(DTAB)，十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)，十六烷基三甲基铵氯化物(CTAC)，二十六烷基二甲基溴化铵(DHAB)，十二烷基硫酸钠(SDS)和辛基硫酸钠(SOS)均购买于Aladdin生物技术有限公司；分析级的乙醇购自天津市Kermel试剂公司；1,1-二苯基-1-甲基苯并肼(DPPH)，抗坏血酸(Vc)和丁基羟基甲苯(BHT)购自Sigma-Aldrich(德国)；用Milli-Q水净化系统制备去离子水；补骨脂素以及佛手柑内酯的标准品(>98%)购买于上海源叶生物技术有限公司。

仪器与设备：旋转蒸发仪型号为RE25AA；BT25S型电子分析天平；W891型烘干机；MAS-Ⅱ型微波仪；22R型高速离心机等。

1.2 实验方法

1.2.1 原料预处理

选取七、八月份新鲜无明显枯萎和虫害的无花果叶于阴凉干燥处阴干直到重量不变，粉碎至60目后于4℃下放置在密封袋里进行低温避光保存。取用时应将密封袋取出冰箱放置一段时间，待粉末达到室温后再打开袋子进行称重，避免无花果叶子吸潮影响称量。

1.2.2 组成成分的研究

本实验采用高效液相色谱对无花果叶有效成分进行分析，HPLC分析方法是在具有Diamonsil C18反相柱(250 mm×4.6 mm，5 μm，Dikma，北京)的Agilent 1200系列液相色谱系统上开发的。以下为补骨脂素以及佛手柑内酯的标准曲线。

表1 补骨脂素和佛手柑内酯回归数据

Table 1 Regression data，LODs and LOQs forpsoralen and bergapten

分析物Analyte标准曲线Calibration curve相关系数R2(n=8)线性范围Linearity range(μg·mL-1)检出限LOD(μg·mL-1)定量限LOQ(μg·mL-1)补骨脂素PsoralenY=83.25X+1.870.99995～1000.170.52佛手柑内酯BergaptenY=138.25X-2.240.99985～1000.200.62

注：X.标准品浓度(μg·mL-1)；Y.峰面积

Note:X.Standard concentration(μg·mL-1)；Y.Peak area

1.2.3 阴阳离子表面活性剂联合微波辅助提取

准确称取1.0 g无花果叶粉末溶于一定量的水中，加入配制的一定比例的表面活性剂溶液后混匀直到溶液稳定，置于微波提取器中，按照一定条件进行微波提取，反应结束后取出，定容，过滤，离心，并用微孔滤膜过滤后进行HPLC分析其成分及含量，重复3次取平均值。

1.2.4 实验过程的优化

不同的实验条件对最终的提取率有一定程度的影响，此处分别对包括复配的表面活性剂的种类及其浓度、液固比、微波时间及温度等实验参数进行优化，每组实验重复3次取平均值。其中无花果叶中主要目标成分的提取率的计算为

提取率(mg·g-1)=(C×V)/M

(1)

式中：C为样品溶液中所测物质的浓度(mg·mL-1)；V为样品溶液体积(mL)；M为无花果叶粉干重(g)。

1.3 初步功能性评价

1.3.1 抗氧化性质检测

DPPH抗氧化性能力的测定：取1 mL样品浓度为0.004%的DPPH乙醇溶液于黑暗条件下与样品溶液混合，待稳定后再与一定体积的乙醇溶液混合，黑暗条件下静置，70 min后在517 nm下进行吸光度测定，Vc作为对照，重复测定3次。

抗氧化能力(Ip)=[(AA-AB)/AB]×100

(2)

式中：AA与AB分别为70 min后待测样品和空白的吸光度值。

ABTS抗氧化能力的测定：量取200 μL的ABTS工作液与10 μL的样品溶液混合，待溶液均匀后在黑暗条件下静置2～6 min后于734 nm处测定吸光度值，重复测定3次。

还原力的测定：量取500 μL的磷酸缓冲液(0.2 mol·L-1，pH6.6)同相同体积的1%[K3Fe(CN)6]溶液混合，加入相同体积的样品溶液，于50℃下水浴反应25 min后快速取出，加入冷水使其快速冷却，加入相同体积的10%三氯乙酸，3 000 r·min-1条件下离心10 min，取上清液500 μL同相同体积的蒸馏水及FeCl3混和均匀，在静置10 min后在700 nm下进行测定吸光度，重复测定3次。

1.3.2 稳定性检测

在生产应用中，产品的储备时间也是一个衡量产品标准的重要指标。众所周知，无花果叶中的主要成分补骨脂素是一种光敏感型的化合物，经常会发生不可逆转的降解。但是其本身也是十分重要的抗皮肤炎症等的有效物质，所以在生产过程中保留原有物质本身性质的同时提高本身的抗降解率也是十分必要的。所以本实验衡量了相同提取含量下，加入一定量的复配型表面活性剂，与原材料进行对比，研究在相同条件下，不同天数无花果叶中主要物质的含量变化情况。

具体实验操作步骤：取相同体积的样品溶液进行放置实验，分别测得在第1、3、5、7天中，补骨脂素的含量与最开始原始的含量进行百分比测试。制定的降解折线图能直观地对比出二者的稳定性能力。

2 结果与分析

2.1 单因素结果选择

2.1.1 表面活性剂种类对无花果叶中目标成分提取率的影响

为了获得最佳的提取效果，如图1所示，选择了4种复配的表面活性剂体系进行筛选，分别为DTAB/SDS，CTAB/SOS，CTAC/SOS和DHAB，可以发现表面活性剂的加入与常规水溶液提取有较明显的提高[11]，当使用DTAB/SDS作为萃取溶剂时，所有分析物的提取效率达到最高。DTAB/SDS体系具有与阴离子和阳离子表面活性剂相同的烷基链长，与其他研究的体系相比，这可能导致更紧密、更稳定的极性层聚集体。此外，DTAB/SDS体系的独特性质以及与目标分析物的特殊相互作用可能更加有助于提取，反观，DHAB的提取效率最低，这可能是由于DHAB的电荷密度较低的缘故。与带相反电荷的表面活性剂形成的其他体系相比，静电相互作用弱，因此，选择DTAB/SDS体系为最佳的提取溶剂。

图1 表面活性剂种类对目标产物提取率的影响Fig.1 The effect of the formulated surfactant types on the extraction yield of target compounds

图2 表面活性剂浓度对目标产物提取率的影响Fig.2 The effect of the formulated surfactantconcentrations on the extraction yield of target compounds

图4 提取时间对目标产物提取率的影响Fig.4 Effect of differentextraction time on the extraction yield of target compounds

图3 液固比对目标产物提取率的影响Fig.3 Effect of different liquid to solid ratio on the extraction yield of target compounds

图5 提取温度对目标产物提取率的影响Fig.5 Effect of extraction temperatureon the extraction yield of target compounds

2.1.2 表面活性剂浓度对无花果叶中目标成分提取率的影响

为了获得最高的提取效率，在相同实验条件下，在0.1%～5.0%(w/v)的范围内对表面活性剂浓度进行了研究。结果如图2所示，目标化合物的提取量随着浓度增加呈正态分布趋势。当浓度过低时可能导致与底物接触不完全，达不到彻底的提取。增加DTAB/SDS的浓度可以通过增强氢键与目标分析物的疏水—亲水相互作用来提高提取率。但是，将浓度进一步从1%(w/v)增加到5%(w/v)会导致目标分析物的提取效率降低或保持不变。分析原因可能是在1%(w/v)的浓度附近达到了动力学提取平衡，进一步增加浓度可能使原表面活性剂单体开始沉淀。此外，过高的浓度会导致溶液本身较为粘稠，传质受到阻碍，导致分析物在水相中的溶解度受到影响。基于上述原因，选择1%(w/v)作为DTAB/SDS提取目标产物的最佳浓度。

2.1.3 液固比对无花果叶中目标成分提取率的影响

如图3所示，当提取时间固定时，目标成分的提取率随液固比的变化呈先增加后有轻微下降。然而当液固比较小时，材料底物与表面活性剂的接触不够充分，提取效率就较低。但是当液固比过大时，不仅会造成不必要的浪费，还会使得溶液体系稀释过度，表面活性剂在短时间内捕获目标化合物不够完全，导致提取率轻微下降。如图3所示，当液固比达到30∶1时，可以达到较高的提取效率同时还不会造成过多的浪费，符合绿色节能的发展理念。

2.1.4 时间对无花果叶中目标成分提取率的影响

从图4中可以看出，提取时间在10 min时候呈现出了最大值，补骨脂素与佛手柑内酯分别为15.21与3.57 mg·g-1。随后在15 min后又有轻微的下降，分析原因可能是由于积累的时间导致了容器内温度的增加，过热的温度会对目标化合物的结构产生破坏从而降低最终的产量。而在5 min时产量较低，应该是由于底物与提取溶剂的接触时间不够充分，在较短的时间内不能够完全地将目标化合物捕获，导致最终的产量下降。但是过长的时间不仅仅会造成能源的浪费，反而会引发能量积累对最后的产量产生不利的影响。所以选取最适合的提取时间10 min，不仅会减少能量消耗，缩短时间提高效率，还可以最大程度地将目标化合物提取出来。

2.1.5 温度对无花果叶中目标成分提取率的影响

温度是影响分子运动快慢的一个重要因素，所以，探索不同温度下对提取效率的影响是十分必要的。从图5中可以看出，在温度30℃、40℃、50℃、60℃的情况下，总提取效率呈现先上升后接近平缓的趋势。其中，当温度达到40℃时，补骨脂素及佛手柑内酯的提取率达到了最大(见图5)，分别为15.37和3.59 mg·g-1。分析原因可能是在较低的温度下，分子间的运动较慢，不利于表面活性剂分子与目标化合物的接触，阻碍了反应高效、有序地进行。随着温度的升高，分子间的运动加快，在一定时间内接触的更加充分彻底，能够让反应更加完全。但是随着温度的进一步增加，总提取效率并没有呈现出线性增加，而是更加趋近于平缓。这就说明了在一定时间内，在高于40℃的条件下，分子之间的接触已经达到了完全的充分，过高的温度可能会加快分子之间运动的进行但是并不会提高最终的产量。此外，过高的温度可能会对表面活性剂内部的复配造成化合键的断裂，影响了与化合物之间的络合。最重要的是，温度过高还可能造成无花果叶中主要成分的降解，影响最终的获取率。所以综合以上的分析，本实验采用40℃作为最适合的提取温度，在保证最高提取效率的同时减少能源损耗，达到绿色发展的理念。

2.2 初步功能评价

2.2.1 抗氧化性质的研究

通过抗氧化实验的测定可以得出的结论是，在加入了一定浓度的阴阳离子复配型表面活性剂后，无花果叶的粗提物的抗氧化能力有明显的提升，其中溶液的DPPH的IC50由0.107 mg·mL-1下降到了0.095 mg·mL-1，ABTS自由基清除能力也由0.503 mmol·g-1上升到了0.794 mmol·g-1，以BHT为对照，还原力IC50值降低了0.038 mg·mL-1。所以，不仅作为一种有效的提取剂，表面活性剂还可以作为一种绿色的抗氧化剂，保证所需要的活性成分在储备和运输过程中得到较好的保护，为许多工业化生产，比如化妆品，药品等生活必需品的制备，提供了有价值的依据和参考。

表2 无花果叶不同溶剂提取物的抗氧化结果

Table 2 Antioxidant results of different solvent extracts of fig leaves

商品名Trade nameDPPH IC50(mg·mL-1)ABTS(mmol·g-1Trolox)Reduction ability IC50(mg·mL-1)无花果叶粗提物Crude fig leaf extract0.1070.5030.183无花果叶粗提物与表面活性剂Fig leaf crude extract and surfactant0.0950.7940.145Vc0.0641.034—BHT——0.136

图6 不同提取溶液的稳定性研究Fig.6 The study on the stability of extraction solution

2.2.2 稳定性的比较

无花果叶中补骨脂素为光敏感型物质，如果没有进行遮光处理十分容易降解。由实验得知，与初始浓度相比，没有加入表面活性剂的一组在1、3、5、7 d分别为80%、50%、40%和35%，而加入了表面活性剂的一组则为83%、70%、60%以及50%。从图3可以看出来，无花果叶粗提物与表面活性剂的组合整体下降趋势线的斜率要小于单独的无花果叶粗提物，说明在相同的条件下，表面活性剂的加入会大大减缓原本极容易降解的物质——补骨脂素的消失，也说明了表面活性剂可以作为一种稳定溶剂，在3～7 d，它的添加使无花果叶粗提物的活性物质的稳定性平均提高了20%，分析原因可能是由于表面活性剂的加入增加了溶液的不透光性，光敏性物质比如补骨脂素以及佛手柑内酯等受到了较少的影响。还可能是因为表面活性剂的加入降低了整体溶液的表面张力，所以与空气接触的面积相对较低，不容易被空气中的氧化物质所氧化。同时研究2.2.1也表明，表面活性剂的加入会导致整个体系的抗氧化能力的增强，所以对目标化合物的降解具有一定程度的缓冲作用。在现代医疗美容等行业中，表面活性剂的加入会大大的降低产品的损失，提高产品使用效率，从而经济和绿色发展也得到了较好的效果，具有较大的开发价值。

3 结论

本研究完成了阴阳离子复配表面活性剂溶剂微波辅助提取无花果叶中主要目标成分的提取工艺的优化，最佳工艺条件为1%(w/v)的十二烷基硫酸钠(SDS)与十二烷基三甲基溴化铵(DTAB)，液固比为30∶1，提取时间为10 min，温度为40℃，在此条件下，补骨脂素与佛手柑内酯的提取量分别为15.37和3.59 mg·g-1。通过体外抗氧化实验以及稳定性实验对阴阳离子复配型表面活性剂的功能进行初步评价，为合理、有效开发利用无花果叶资源提供了必要的科学依据，同时对植物中天然有效目标产物的绿色高效提取以及功能评价具有十分重要的理论指导意义。