脂联素通过Nrf2/HO-1通路对急性心肌梗死大鼠心功能和心肌细胞凋亡作用的机制研究

李媛莉，赵继波，张三明

急性心肌梗死（AMI）后的氧化应激反应和细胞凋亡是心功能损伤的主要机制，改善氧化应激反应和抑制急性心肌缺血后的细胞凋亡是治疗AMI的主要策略[1]。核因子E2相关因子2（Nrf2）/血红素加氧酶-1（HO-1）通路是调节氧化应激的关键通路，在AMI继发损伤中发挥重要作用[2]，研究显示激活Nrf2/HO-1通路可缓解缺血再灌注后心肌损伤[3]。脂联素（APN）是一种由脂肪细胞分泌的细胞因子，具有调节新陈代谢、保护血管和心脏的作用。最新研究显示在心肌缺血再灌注损伤大鼠模型中，APN的水平显著降低，且APN水平与心肌梗死面积呈负相关[4]，提示其具有保护AMI心肌损伤的作用。本文分析APN对AMI大鼠心功能的影响，并探究其对Nrf2/HO-1影响的保护机制。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂和材料选取45只SPF级雄性SD大鼠220～250 g（南京金陵医院，中国），APN（Sigma公司，美国），Mayer's苏木精和0.5%曙红水溶液（H8070，DH0050，北京Solarbio公司，中国），酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒、TUNEL凋亡试剂盒（碧云天公司，中国），酶标仪（Model 680，Bio-Rad，美国），RIPA裂解缓冲液（中国，北京，Beyotime），BCA蛋白测定试剂盒（北京Applygen公司，中国），抗体购自美国Abcam公司，PVDF膜（Bio-Rad公司，美国）。小动物超声成像仪（麟得科学仪器有限公司，中国），BX-42光学显微镜（Olympus Corporation，日本）。

1.2 动物分组、建模和干预45只大鼠随机分为3组：Sham组、AMI组和AMI+APN组，每组各15只。AMI组和AMI+APN组大鼠通过结扎方法建立AMI模型[5]，首先腹腔注射1%戊巴比妥（剂量为3 ml/kg）麻醉大鼠，麻醉后连接心电图，剪开胸腔暴露心脏，使用6/0线在左心耳下约2 mm处的冠状动脉前降支结扎。结扎后心电图显示大鼠心电图显示QRS波增宽，则为结扎成功，保持结扎30 min后，取出丝线进行再灌注，缝合胸腔。术后注射8万单位的青霉素抗感染干预，持续3 d。Sham组打开胸腔暴露心脏但不结扎，缝合胸腔后注射青霉素，方法与AMI组相同。AMI+APN组大鼠在建模第2 d使用APN腹腔注射，剂量为10 μg/kg，Sham组和AMI组给予等量生理盐水干预1/d，连续7 d。

1.3 观察指标及方法

1.3.1 心功能指标通过超声成像仪行心脏功能检查，检测指标包括左室射血分数（LVEF）和左室内压力最大/小变化率（±dp/dt max）。

1.3.2 心肌酶指标大鼠麻醉后处死，收集血液样本，在2000 rpm离心20 min后，取上层血清。应用ELISA试剂盒检测肌酸激酶（CK-MB）和乳酸脱氢酶（LDH），根据说明书加入抗体，通过酶标仪检测吸光度，根据标准曲线计算浓度。

1.3.3 HE染色大鼠处死后取出心脏，并将心脏组织在室温下用4%多聚甲醛中固定过夜，室温下通过梯度浓度的乙醇处理（80%持续2 h，90%持续2 h，95%过夜，100%分别持续0.5 h、0.5 h和1.0 h），然后包埋在石蜡中。将石蜡样品切成4 μm厚的切片，Mayer's苏木室温下精染色10 min，0.5%曙红水溶液室温下染色3 min。细胞核和其他酸性结构被染成蓝色，而细胞质被染成红色。使用光学显微镜以×400放大率采集图像。

1.3.4 TUNEL染色检测心肌细胞凋亡心肌组织按照1.3.3的方法将组织固定并切成10 μm的厚度切片，使用DAPI染色细胞核，加入TUNEL试剂染色凋亡细胞。在显微镜×400放大倍数下随机选择五个视野，蓝色荧光为细胞核，呈现绿色荧光的细胞计为凋亡细胞，凋亡率=（绿色荧光细胞数目/视野中细胞核总数目）×100%。

1.3.5 Western blot在液氮下将心肌组织研磨并使用RIPA裂解缓冲液裂解，用BCA蛋白测定试剂盒测量总蛋白含量。SDS-PAGE分离等量的总蛋白（120 V下电泳90 min），将蛋白转移到PVDF膜上（50 V，120 min），在含5%脱脂牛奶的封闭溶液中封闭。将PDVF膜与anti-Nrf2、anti-OH-1（1:500稀释）4°C孵育过夜，加入1:5000稀释的HRP偶联二抗在室温下孵育1 h。应用ECL试剂盒可视化蛋白条带，ImagePD软件使用GAPDH作为内参对蛋白条带的灰度进行定量。

1.4 统计学处理所有实验设立3个复孔作为平行实验。数据以平均值±标准偏差（SD）表示。统计分析使用SPSS 19.0软件。3组间比较进行单因素方差分析，两两比较使用SNK-q检验。统计学显着性表示为P＜0.05。

2 结果

2.1 APN对AMI大鼠心功能的影响AMI组大鼠LVEF（44.24±6.58%）、±dp/dt max（3.84±1.16×103mmHg/s，2.81±0.90×103mmHg/s）水平显著低于Sham组（P＜0.05），AMI+APN组LVEF（61.46±6.54%）、±dp/dt max（4.89±1.45×103mmHg/s，3.52±1.33×103mmHg/s）水平显著高于AMI组（P＜0.05）（表1）。

表1 各组大鼠LVEF和±dp/dt max比较

2.2 APN对AMI大鼠心肌酶指标的影响AMI组CK-MB（109.68±9.65 kU/L）和LDH（134.26±11.92 kU/L）显著高于Sham组（P＜0.05），AMI+APN组CK-MB（71.69±8.74 kU/L）和LDH（97.56±12.44 kU/L）显著低于AMI组（P＜0.05）（表2）。

2.3 心肌HE染色结果Sham组心肌细胞形态呈梭形，且细胞与细胞之间排解紧密。AMI组心肌细胞形态异常，细胞间出现大量空隙并排列紊乱。AMI+APN组心肌细胞排列基本正常，空隙显著减少（图1）。

表2 各组CK-MB和LDH水平比较

图1 HE染色检测心肌组织损伤情况（×400）

2.4 各组心肌细胞凋亡情况比较蓝色荧光为细胞核，绿色荧光为凋亡细胞。AMI组的凋亡率（44.21±3.98%）显著高于Sham组（3.18±0.08）（P＜0.05），AMI+APN组心肌细胞凋亡率（23.58±3.78%）显著低于AMI组（P＜0.05）（图2）。

2.5 各组Nrf2/HO-1通路水平比较与Sham组比较，AMI组Nrf2和HO-1水平显著降低（P＜0.05），AMI+APN组Nrf2和HO-1水平显著高于AMI组（P＜0.05），（表3、图3）。

图2 TUNEL染色检测心肌细胞凋亡情况（×400）

表3 各组Nrf2和HO-1蛋白水平比较

3 讨论

AMI是世界范围内引起人类死亡的主要原因之一，心肌组织的血液灌注受阻会引起氧自由基等活性氧物质的产生增加，促进有害细胞信号的激活，引起血管内皮细胞或心肌细胞的炎性细胞因子和趋化因子的表达，导致炎性反应并引起心肌损伤，缓解氧化应激反应是治疗AMI的重要途径[6]。

图3 Western blot检测Nrf2/HO-1通路中蛋白水平

APN是一种由脂肪细胞和心肌细胞分泌的细胞因子，有调节线粒体的作用，APN降低会引起线粒体损伤和氧化应激反应。最新研究发现，APN与ST段抬高型AMI患者病情有关，病变越重的患者APN水平越低[7]。徐小静等[8]研究也显示了APN与缺血引起的组织损伤有关。有体内实验显示APN干预可缓解2型糖尿病大鼠的氧化应激水平[9]。据此我们推测APN可能会缓解AMI引起的心肌损伤。本文通过结扎方法建立AMI大鼠模型，并通过心电图证实建模成功，用腹腔注射APN干预。结果显示应用APN干预后，大鼠心肌损伤情况显著缓解，并降低了心肌酶指标，具有改善心功能的作用。通过本研究，我们发现APN干预可有效缓解AMI引起的心肌损伤并保护心功能。

为进一步探究APN缓解AMI心肌损伤的机制，我们对心肌细胞的凋亡情况进行检测。梗死区域以及后续心肌细胞的损伤和凋亡是引起AMI患者心肌损伤和心功能受损的重要病理基础，这会导致左心室重塑、纤维化甚至心力衰竭，抑制梗死后心肌细胞凋亡是保护心肌功能的重要途径[10]。本实验显示，AMI组凋亡率（44.21±3.98%）显著高于Sham组（3.18±0.08），AMI+APN组心肌细胞凋亡率（23.58±3.78%）显著低于AMI组，说明APN可显著缓解AMI引起的心肌细胞凋亡。Nrf2/HO-1通路是抗氧化的重要途径，研究显示Nrf2和HO-1水平上调可缓解缺血引起的氧化应激损伤[11]，且Nrf2/HO-1通过调节氧化应激或炎性反应的方式，直接调控心肌细胞的凋亡[12,13]。本研究还显示AMI组Nrf2和HO-1水平显著低于Sham组，AMI+APN组Nrf2和HO-1水平显著高于AMI组。有研究显示APN可通过激活Nrf2相关通路改善高血糖引起的心脏肥大和功能障碍[14]。Enji等[15]研究显示APN具有激活Nrf2通路的作用。这提示在AMI大鼠模型中，APN可能通过激活Nrf2/HO-1通路抑制心肌细胞凋亡。

综上所述，APN可能通过促进Nrf2/HO-1通路抑制AMI模型大鼠的心肌细胞凋亡，从而发挥保护心功能的作用。但关于APN对AMI的影响及调控Nrf2/HO-1通路的机制仍需进一步研究。