以鼠李糖脂制备微乳液及在化妆品中的应用

骆宇璐，孟 琴

浙江大学化学工程与生物工程学院，浙江 杭州 310058

生物表面活性剂是包含由植物、动物和微生物合成的一类具有表面特性的两亲性分子。其中，微生物表面活性剂由于具有低毒性、可生物降解、生态安全、极低的临界胶束浓度值（CMC）以及独特的生物活性等特点，引起了广泛的关注[1]。由于微生物表面活性剂的上述优良特性，普遍被认为在化妆品工业中具有极大的应用潜力[2]。

鼠李糖脂是一种主要以铜绿假单胞菌为菌体发酵而来的生物表面活性剂[3]，表面性能良好，中性水溶液中其临界胶束浓度为0.1 mmol/L[4-5]，比常见的化学离子表面活性剂低近1～2个数量级（如常温下十二烷基硫酸钠的CMC为8.1 mmol/L，月桂酸钠的CMC为24.4 mmol/L）[6]。此外，鼠李糖脂除眼睛刺激以外，几乎没有皮肤刺激性，具有良好的生物相容性[7-9]。鼠李糖脂具有较优的生物活性，据报道其可调节皮肤毛细血管扩张治疗红血丝[10]、通过调节真皮中肥大细胞的脱粒治疗皮肤过敏[11]、抑制皮肤纤维化促进伤口愈合[12]及促细胞渗透[13]等，也有报道指出鼠李糖脂在化妆品中具有抗菌、抗皱纹和抗衰老作用[14-15]。

微乳液是一种外观澄明、热力学稳定的分散体系。相比于传统剂型，微乳液可改善活性成分在皮肤中的扩散性和渗透性，提高产品效率和稳定性，改善外观[16]。以微乳液形式制备的化妆品，具有良好的化妆品特性和高水合特性，施用于皮肤后能减少刺痛和刺激，并带来良好的肤感[17]。近年来，已有部分研究报道了以鼠李糖脂作为表面活性剂的微乳体系的构建，但主要集中在药物载体、生物柴油和环境修复方面[5,9]，尚未见其用于化妆品中的研究报道。

本工作旨在开发以鼠李糖脂作为表面活性剂的微乳护肤品，以期得到性能优良且具有护肤作用的制剂，为生物表面活性剂在微乳剂型化妆品中的应用提供必备的技术基础。

1 实验部分

1.1 乳化能力和乳化稳定性测定

根据文献[18]的方法测定乳化能力（EC）和乳化稳定性（ES）。在离心管中将2 mL鼠李糖脂溶液与2 mL油相混合，用均质器持续剧烈搅拌120 s，重复两次。最后将乳液在4 000r/min下离心5 min。测量乳液的总体积记为Wv，乳化层体积记为Lv。乳化能力（EC）的计算公式：

将乳液在室温下保存7 d，然后在4 000 r/min下离心5 min，记录重新离心后乳化层的体积（LN），将它与原乳化层体积（Lv）相比，测定鼠李糖脂的乳化稳定性，其计算公式：

1.2 伪三元相图的绘制

使用油滴定法来绘制鼠李糖脂微乳液的伪三元相图。参考文献[19]方法，固定助表面活性剂和表面活性剂的比（Km）为2:1，改变水对混合表面活性剂的质量比，分别在1:9，2:8，3:7，4:6，5:5，6:4，7:3，8:2和9:1等一系列的固定质量比下，在漩涡振荡的同时用选定的油相进行滴定，直到体系由浑浊变为澄清，或由澄清变为浑浊，直至该状态不再改变。通过肉眼观察对混合物进行定性分析：澄清、透明、黏度低且使用激光笔平行光入射后激光成束不分散的为微乳液；不透明、浑浊的乳状液为普通乳剂。记录发生临界相变时的加入质量，使用Origin 8.0绘制伪三元相图。

1.3 微乳理化性质的测定

在微乳区域中选取3个不同的点作为微乳的配方，配制3种微乳液，并按照下述方法评价其理化性质：微乳外观性状评估，在室温和非阳光直射条件下肉眼观察所制得的微乳的澄清度和均匀度；微乳pH值测定，在室温条件下，用pH计测定所制得微乳液的pH值，重复测试3次，记录结果；微乳类型判断，使用染色法判断微乳液的类型，其中，亚甲基蓝为水溶性染料，苏丹红为油溶性染料；微乳的黏度测定，在20 ℃的恒温下，使用旋转黏度计测定制得的微乳液的黏度；微乳粒径分布和Zeta电位，取已制备好的鼠李糖脂微乳液用纯水稀释至相同的倍数，使用纳米粒度电位分析仪测定其粒径大小和Zeta电位。

1.4 微乳精华的制备及评价

1.4.1 微乳精华的配方设计选取两种综合性能良好的配方作为精华微乳的基底，再添加鼠李糖和木糖醇作为肌肤调理剂，添加苯氧乙醇作为防腐剂，搅拌均匀，制备相应的精华微乳。

1.4.2 微乳精华稳定性分析

按照文献[20]和国家标准GB/T 29665-2013分别评估所制备的微乳精华液的离心稳定性、耐寒耐热性和储存稳定性。

1.4.3 微乳精华功效评估

选择20～30岁无过敏史且受试部位近3个月未参加其他临床试验者的女性志愿者8名，分别选取手背上固定区域，使用数字皮肤测试仪分别测试使用精华微乳前后皮肤的水分含量及皮肤弹性，评价精华微乳对皮肤状态的改善情况，其中皮肤弹性以1～5分分别表示粗糙、偏粗糙、一般、偏柔细和柔细5种等级。

2 结果与讨论

2.1 微乳的制备

2.1.1 油相的选择

表面活性剂的乳化效果通常由两部分综合评价：乳化能力评估其促进乳液形成的能力，乳化稳定性表示乳化期间和之后其对细小液滴的稳定能力[18]。选择3种化妆品中常用油相角鲨烷、异十六烷和荷荷巴油，测定鼠李糖脂的EC和ES，其结果见表1。可以看到，鼠李糖脂在不同油相中的表现力是不同的。其中在角鲨烷中的乳化效果是最好的，且乳化能力受鼠李糖脂质量浓度影响较小。其次是异十六烷，其乳化能力随所使用的鼠李糖脂浓度增加而增加。在荷荷巴油中鼠李糖脂的乳化效果最差。荷荷巴油实际是一种液态的植物蜡，其由多种不饱和脂肪酸与少量饱和脂肪酸组成，可能是由于荷荷巴油成分复杂导致乳化效果差。另有文献[9]指出，鼠李糖脂在烷烃中的乳化活性随所含碳原子数的增加和烷烃支链化程度的降低而增加，角鲨烷和异十六烷的结果对比发现符合该规律。结合乳化稳定性，鼠李糖脂质量浓度在1%～2%时，在角鲨烷中的稳定性也优于异十六烷和荷荷巴油，因而在后续使用鼠李糖脂配制微乳时选择角鲨烷作为油相。

表1 鼠李糖脂的乳化能力和乳化稳定性Table 1 Emulsifying capacity (EC) and Emulsifying stability (ES) of rhamnolipids

2.1.2 伪三元相图的构建

丙三醇（甘油）作为短链醇可以降低水油两相间的界面张力，增加鼠李糖脂溶解性，同时用于化妆品中能起到保湿和润肤作用[21]，因此，本工作选择甘油作为助表面活性剂。图1为绘制得到的鼠李糖脂-角鲨烷-甘油-水体系的相图，其中B，W和O分别表示以甘油和鼠李糖脂组成的混合表面活性剂、角鲨烷和水相，阴影区域为鼠李糖脂的微乳区。结果显示，在水含量增加和表面活性剂含量较大时，能形成微乳状液区。

图1 鼠李糖脂微乳的伪三相图Fig.1 Pseudo three-phase diagram of rhamnolipid microemulsion

2.1.3 微乳的制备

选取伪三相图中微乳区的3种不同配方配制微乳液，具体配方见表2。其中配方1和配方2的混合表面活性剂质量分数（w）相同，但配方1的角鲨烷质量分数高于配方2。配方2和配方3的角鲨烷质量分数一致，但配方2的混合表面活性剂质量分数高于配方3，而水量低于配方3。将鼠李糖脂与甘油和水按照配比在60 ℃下超声溶解均匀混合后，使用漩涡振荡仪一边搅拌一边滴加角鲨烷。最终得到均一透明的鼠李糖脂微乳液，其在4 000 r/min下高速离心10 min仍不分层。

表2 鼠李糖脂微乳液的配方Table 2 Formula of microemulsion of rhamnolipids

2.2 微乳的理化性质

3种配方下得到的微乳液均澄清透明，呈淡黄色[（如图（2a）]，三者均匀度良好，其中配方1得到的澄清度相对较低，配方2和配方3澄清度最佳。由表3中三者的黏度可知，在流动性上从大到小依次为配方3，配方2，配方1。测定其pH值，三者均呈弱酸性，为6.0±0.1。使用染色法来判断微乳液的类型，结果如图2（b），可以看到3种配方下，均是亚甲基蓝染液比苏丹红染液扩散更快。由于亚甲基蓝为水溶性染料而苏丹红为油溶性染料，说明由鼠李糖脂制备的3种配方的微乳液均为O/W型微乳液。

图2 鼠李糖脂微乳的外观（a）及类型判断（b）Fig.2 The rhamnolipids microemulsion with different formula (a) and the judgement of their types (b)

粒径和Zeta电位是考察微乳稳定性的2个重要参数，3种不同配方的微乳制剂的粒径分布情况与Zeta电位结果见表3。1#乳液的平均粒径约100 nm，属于亚微乳范畴，2#和3#乳液的平均粒径在44 nm左右。从Zeta电位判断可知微乳均带负电，其中3#的带电性最强，其粒子间排斥力最大，有利于提高其溶液稳定性。兼顾2#乳液的带电性高和粒径小的双重特征，其稳定性应该高于其它两种乳液。另外，从表3中可以看出1#乳液的粒子聚集程度（PDI）明显高于其它两种乳液，这可能是由于1#乳液含较多的黏性物质角鲨烷和甘油量，增加了溶液的黏度，而削弱了其分子运动程度，造成粒径分布不够均匀。比较三者的配方成分，可以得出，油相的含量对微乳粒径影响较大。当油相含量较高时，制备得到的微乳液具有更大的粒径分布和PDI。

表3 鼠李糖脂微乳液的理化性质Table 3 Physical and chemical properties of rhamnolipids microemulsion

2.3 微乳精华的制备及理化性质

根据表4的配方制备微乳精华，外观如图3所示。由图可知，二者的澄清度和均匀度良好，测定其黏度可得配方1和配方2的平均黏度分别为66.3 mPa·s和58.5 mPa·s，流动性较2.1中还有一定的提升。测验其pH值，二者的pH值仍在6.0左右，接近人类皮肤的pH值。

图3 精华微乳的外观Fig.3 The appearance of essence microemulsion

2.4 微乳精华的稳定性分析

取制备好的两类精华微乳制剂分别评估其离心稳定性、耐寒耐热性和储存稳定性，评估结果见表5。由表可知，两种微乳精华在4 000 r/min的转速下离心30 min，无分层现象，离心稳定性良好。分别置微乳精华于40 ℃和-10 ℃下恒温保存24 h后，然后存放于室温下，发现该乳液无油水分层现象且无色泽及流动性变化。此外，在室温条件下储存制备好的精华微乳15，30和60 d之后高速离心，同样无油水析出且色泽/流动性变化，符合国家标准GB/T 29665-2013的指标。综上，在两种配方下得到的精华微乳，离心稳定性、耐热耐寒性与储存稳定性都良好。

2.5 微乳精华的功效评价

以蒸馏水作为空白组对照（记为A0），配方1和配方2的效果记为A1和A2，欧莱雅复颜抗皱紧致滋润乳液（市售产品）作为阳性对照记为AP。每隔一段时间测试不同志愿者使用不同配方后所测部位的皮肤弹性和水分值，其结果如图4所示，其中图4（a）中A1和A2的曲线重叠。可以看到，无论测试组还是对照组，均在使用后5 min能使皮肤的弹性程度与水分值达到一个高峰，之后空白组的皮肤状态会很快恢复到使用前的水平，而配方1和配方2及市售精华乳虽在施加5 min后对皮肤的改善效果会略有下降，但在测试的2 h内，皮肤的弹性程度基本能提升1个档次且能维持平稳。而通过皮肤水分测试，发现1 h内两种配方及市售精华乳均能使其增加20%以上，且2 h内能在皮肤表面锁住一定量的水分，有一定的保湿效果。其中配方2对于皮肤水分的提升效果甚至优于市售精华乳。

图4 不同配方微乳精华使用前后的皮肤弹性和水分值变化Fig.4 Changes in skin elasticity and moisture values before and after using microemulsions of different formulas

鼠李糖脂是从微生物利用植物油脂为主要原料发酵得到，其制备过程从原料到生产过程都十分吻合绿色化工的各项要求，且产品表面性能优秀[4-5]，可部分替代石油基化学表面活性剂。另外，鼠李糖脂的健康特性、可降解性以及多种护肤活性[8-9]使其具有较强竞争力的化妆品原料。本工作对鼠李糖脂制备微乳液的研究结果表明，所得到的微乳液具有理想的物理化学性质、储存稳定性和护肤活性，所得到的鼠李糖脂微乳液制备工艺将推动其在化妆品工业的实际应用。

3 结 论

使用生物表面活性剂鼠李糖脂配制微乳，构建鼠李糖脂-角鲨烷-甘油-水微乳体系，可得到粒径在44 nm左右稳定性良好的微乳液。在鼠李糖脂-角鲨烷-甘油-水微乳体系基础上配制微乳精华护肤品，通过理化性质测定、稳定性分析、主观评估和功效评价，可得到最佳配比为：鼠李糖脂14.4%，甘油28.9%，角鲨烷8.7%，鼠李糖1.4%，木糖醇1.4%，苯氧乙醇1.0%，蒸馏水44.2%。使用该配方得到的微乳精华外观澄清透明，流动性良好，pH值在6.0左右，稳定性较强，能改善皮肤的弹性并提升水分值，且在2 h内该作用能得到保持。总之，鼠李糖脂适合制备面向化妆品工业应用的微乳液。