还原型谷胱甘肽片改善酒精性肝损伤的作用及机制研究*

葛炜炜，吴 育**，刘兆国

1 江苏省南通市中医院 药剂科，南通 226001；2 南通大学 药学院，南通226001

我国是“饮酒”大国，且因之出现酒精性肝损伤发病年龄呈现年轻化的态势[1]，而长期过量饮酒是造成酒精性肝病的重要原因。肝脏是酒精代谢的主要器官，因而肝脏最易受到酒精性损伤。酒精性肝病包括酒精性脂肪肝和慢性炎症，随着疾病的进展，最终发展成为肝纤维化直至肝硬化[2，3]，因而对酒精性肝损伤的预防和治疗显得尤为重要。临床研究已经表明，还原型谷胱甘肽片在乙型肝炎、药物型肝肾损伤方面具有良好的治疗效果[4]，且其发挥药理作用的主要机制是由于其结构中包含有还原性的巯基，具有较强的还原能力有关[5]，但更为深入的机制仍然不清楚。

本实验采用小鼠长期大量酒精摄入构建酒精性肝损伤模型，研究还原性谷胱甘肽片对酒精性肝损伤的保护作用及潜在机制，为临床和后续实验研究提供指导。

1 实验材料

1.1 药物与试剂

还原型谷胱甘肽片（规格：100 mg/片，重庆药友制药有限责任公司，批号：CM8085）；阳性药水飞蓟宾（规格：35 mg/片，天津天士力圣特制药有限公司，批号：950701001）。

小鼠丙氨酸氨基转移酶（ALT）检测试剂盒（批号：20190821）、小鼠天门冬氨酸氨基转移酶（AST）检测试剂盒（批号：20190913）、小鼠碱性磷酸酶（ALP）测定试剂盒（批号：20190913）、总胆固醇（TC）测定试剂盒（批号：20190911）、甘油三酯（TG）测定试剂盒（批号：20190910）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-c）测定试剂盒（批号：20190910）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-c）测定试剂盒（批号：20190913），均购自于南京建成生物工程研究所有限公司；小鼠肿瘤坏死因子α（TNF-α）ELISA 试剂盒（批 号：050201）、小鼠白介素-6（IL-6）ELISA 试剂盒（批号：053452）均购自杭州联科生物技术有限公司；小鼠高迁移率族蛋白B1（HMGB-1）ELISA 试剂盒（批号：L092721）购自武汉华美生物工程有限公司；Trizol 提取液（美国Thermo 公司，批号：101005）；转录试剂盒（南京诺唯赞生物科技有限公司,批号：7E380H9）；Sybrgreen 试剂盒（北京全式金生物科技有限公司，批号：H2357）；羧甲基纤维素钠等化学试剂购自国药化学有限公司。

1.2 仪器

BP211 电子分析天平（德国赛多利斯集团）；Multiskan 型号酶标仪（美国Thermo 公司）；7500 快速实时荧光定量PCR 系统（美国ABI 公司）。

1.3 动物

SPF 级白色ICR 小鼠，体重18～20 g，均为雄性，购自扬州大学比较医学中心，动物生产许可证号：SCXK（苏）2017-0007。实验动物屏障环境设置：12 h/12 h 昼夜光线。

2 实验方法

2.1 酒精性肝损伤小鼠模型的构建和给药

随机将60 只雄性ICR 小鼠等分为6 组，每组为10 只，分别为空白组、模型组、水飞蓟宾阳性药组（50 mg·kg-1）、还原型谷胱甘肽片低、中、高3 个剂量组（200、400、800 mg·kg-1）。待动物适应性饲养后，除空白组外，其余5 组均灌胃给予体积分数（v/v）为50%的乙醇溶液（10 mL·kg-1），用于构建酒精性肝损伤动物模型，连续灌胃6 周[6，7]；从造模当天开始，空白组和模型组均灌胃给予0.5%羧甲基纤维素钠溶液；阳性药组灌胃给予水飞蓟宾溶液；还原型谷胱甘肽片各剂量组给予对应浓度的谷胱甘肽溶液（注：水飞蓟宾和还原型谷胱甘肽片药物，配制时，均采用0.5%羧甲基纤维素钠溶液作为溶剂）。各组灌胃体积均为10 mL·kg-1，动物于给药后4 h 给予酒精造模。

2.2 小鼠体质量和肝脏指数的检测

待造模6 周后，各组动物处理前禁食24 h，采用天平称取小鼠体质量并作记录。动物麻醉后，摘取动物眼球采血；解剖动物，取出肝脏组织，生理盐水清洗、滤纸吸干，迅速置于天平中称取各组每只动物肝脏重量并作记录。小鼠肝组织存入冰箱备用。

2.3 小鼠血清生化因子ALT、AST、ALP 的检测

各组小鼠摘眼球取出全血置于无菌1.5 mL 离心管中，在4 ℃冰箱中静置12 h，1500 r·min-1离心分离小鼠血清，将小鼠血清分装检测。未检测血清置于-80 ℃冰箱冻存备用。参照试剂盒说明书进行检测血清中的ALT、AST、ALP 含量。

2.4 小鼠血清脂质相关因子TC、TG、LDL、HDL 的检测

参照试剂盒说明书，对各组小鼠血清中TC、TG、LDL-c、HDL-c 因子进行检测。

2.5 PCR 检测肝脏TNF-α、HMGB-1、IL-6 的mRNA 水平

分别称取各组小鼠新鲜100 mg 肝脏组织，采用Trizol 提取液提取组织中全部RNA，参照逆转录试剂盒说明书，将RNA 逆转为相应的cDNA，按照Sybr Green 说明书进行PCR 检测，得到各组样本扩增曲线达到阈值的循环圈数（Ct）值，计算ΔCt=Ct目的基因-Ct内参，ΔΔCt=ΔCt样本-ΔCt空白组平均值，采用2-ΔΔCt法定量结果并计算相对表达量。

引物序列为：TNF-α，上游：5’-CCGACCGAATGCAGTTGGA-3’，下游：5’-ACAGAGTATCTGCGC TCCGGA-3’；HMGB-1，上游：5’-CCTCAAGGGCTGCAACGAG-3’，下游：5’-TCAATCACTGTCTTGCCCCA-3’；IL-6，上游：5’-ACTGAAGATCTCCCACG GCA-3，下游：5’-GGCCGCAGAATCAGCCACCA-3’；GAPDH 上游：5’-CCTGGCACCCAGTACAAT-3’，下游：5’-GCTGATCCTCTGCTGGAA-3’。

2.6 Elisa 法检测肝脏TNF-α、HMGB-1、IL-6 炎症因子水平

分别称取各组小鼠新鲜100 mg 肝脏组织，加入1 mL PBS 缓冲液，采用玻璃匀浆器匀浆后，12000 r·min-1离心分离上清液，参照TNF-α、HMGB-1、IL-6因子Elisa 试剂盒说明书检测上述各因子含量。

2.7 肝脏病理学HE 检测

分别称取各组小鼠新鲜肝脏适量，剪取小块肝脏组织，置于10%福尔马林溶液中固定72 h，脱水行常规石蜡包埋，切片，按照染色步骤进行HE 染色，中性树胶封片后，于100 倍显微镜下进行拍照。采用Image-Pro Plus 对切片视野中的脂滴空泡数进行计数和分析。

2.8 统计学方法

3 结果

3.1 还原型谷胱甘肽片对小鼠体质量和肝脏指数的影响

实验过程中动物状态良好，饮食饮水均正常。通过对各组小鼠体质量的检测发现，模型组小鼠体质量与空白组小鼠体质量无显著差异。对各组小鼠的肝脏指数进行检测发现，相较于空白组，模型组小鼠肝脏指数明显增加，提示长期饮酒能够引起动物肝脏肿大；而阳性药组和还原型谷胱甘肽片（400、800 mg·kg-1）各剂量组动物肝指数明显减少，且与模型组相比，差异具有统计学意义（P<0.01），见表1。实验表明，还原型谷胱甘肽片能够缓解小鼠因长期饮酒导致的肝脏肿大症状。

表1 还原型谷胱甘肽片对酒精性肝损伤小鼠体质量和肝脏指数的影响（，n=10）

表1 还原型谷胱甘肽片对酒精性肝损伤小鼠体质量和肝脏指数的影响（，n=10）

注：与空白组相比，**P<0.01；与模型组相比，##P<0.01。

3.2 还原型谷胱甘肽片对小鼠血清ALT、AST、ALP 的影响

通过对小鼠血清中的ALT、AST、ALP 检测发现，动物造模后，模型组小鼠血清中的ALT、AST、ALP 明显增高，且与空白组相比，差异具有统计学意义。治疗后，阳性药水飞蓟宾组和还原型谷胱甘肽片（200、400、800 mg·kg-1）各剂量组血清中的ALT、AST、ALP 明显降低，且与模型组相比，差异具有显著性意义（P<0.01），见表2。实验表明，长期饮酒能够损伤肝组织，而还原型谷胱甘肽片对此种肝损伤具有一定的保护作用。

表2 还原型谷胱甘肽片对酒精性肝损伤小鼠血清ALT、AST、ALP 的影响（，n=10）

表2 还原型谷胱甘肽片对酒精性肝损伤小鼠血清ALT、AST、ALP 的影响（，n=10）

注：与空白组相比，**P<0.01；与模型组相比，##P<0.01。

3.3 谷胱甘肽对小鼠血清TC、TG、LDL-c、HDL-c的影响

对各组小鼠血清中脂质相关的指标TC、TG、LDL-c 以及HDL-c 检测发现，模型组血清中TC、TG、LDL-c 含量明显升高，而HDL-c 含量明显降低，且与空白组相比差异具有统计学意义；采用阳性药水飞蓟宾和还原型谷胱甘肽片治疗后，阳性药物组和还原型谷胱甘肽片（200、400、800 mg·kg-1）各剂量组血清中的TC、TG、LDL-c 含量明显降低，而HDL-c 含量明显升高，且与模型组相比差异具有统计学意义（P<0.01，P<0.05），见表3。实验表明，还原型谷胱甘肽片能够改善小鼠慢性酒精中毒后的脂质代谢异常。

表3 还原型谷胱甘肽片对酒精性肝损伤小鼠血清TC、TG、LDL-c、HDL-c 的影响（，n=10）

表3 还原型谷胱甘肽片对酒精性肝损伤小鼠血清TC、TG、LDL-c、HDL-c 的影响（，n=10）

注：与空白组相比，**P<0.01；与模型组相比，#P<0.05，##P<0.01

3.4 谷胱甘肽对小鼠肝脏中TNF-α、HMGB-1、IL-6 基因表达的影响

对各组小鼠肝脏组织中炎症相关的TNF-α、HMGB-1、IL-6 基因的mRNA 检测发现，模型组肝脏组织中TNF-α、HMGB-1、IL-6 基因的mRNA 水平明显升高，且与空白组相比，差异具有统计学意义；采用阳性药水飞蓟宾和还原型谷胱甘肽片治疗后，阳性药组和还原型谷胱甘肽片（200、400、800 mg·kg-1）各剂量组肝脏中的TNF-α、HMGB-1、IL-6 基因的mRNA 水平明显降低，且与模型组相比，差异具有统计学意义（P<0.01，P<0.05）。见表4。

表4 还原型谷胱甘肽片对酒精性肝损伤小鼠肝脏TNF-α、HMGB-1、IL-6 基因的影响（，n=10）

表4 还原型谷胱甘肽片对酒精性肝损伤小鼠肝脏TNF-α、HMGB-1、IL-6 基因的影响（，n=10）

注：与空白组相比，**P<0.01；与模型组相比，#P<0.05，##P<0.01。

3.5 还原型谷胱甘肽片对小鼠肝脏TNF-α、HMGB-1、IL-6 炎症因子水平的影响

采用试剂盒对各组小鼠肝脏组织中的TNF-α、HMGB-1、IL-6 炎症因子水平检测结果发现，模型组肝脏组织中TNF-α、HMGB-1、IL-6 炎症因子明显升高，且与空白组相比，差异具有统计学意义；采用阳性药水飞蓟宾和还原型谷胱甘肽片治疗后，阳性药物组和还原型谷胱甘肽片（400、800 mg·kg-1）中、高剂量组动物肝脏中的TNF-α、HMGB-1、IL-6炎症因子明显降低，且与模型组相比差异具有统计学意义（P<0.05，P<0.01），见表5。实验表明，还原型谷胱甘肽片可能通过改善模型小鼠肝脏炎症状态，发挥保护肝脏的作用。

表5 还原型谷胱甘肽片对酒精性肝损伤小鼠肝脏TNF-α、HMGB-1 以及IL-6 因子的影响（，n=10）

表5 还原型谷胱甘肽片对酒精性肝损伤小鼠肝脏TNF-α、HMGB-1 以及IL-6 因子的影响（，n=10）

注：与空白组相比，**P<0.01；与模型组相比，#P<0.05，##P<0.01。

3.6 还原型谷胱甘肽片对小鼠肝脏组织形态学的影响

对各组小鼠肝脏组织检查发现，模型组小鼠动物肝脏明显增大，颜色偏向于暗红，且质地较为蓬松，表明长期饮酒导致了肝脏脂肪含量增加，影响肝脏质地。通过肝组织HE 染色发现，相较于空白组，模型组小鼠肝脏炎症水平较高，圆形脂滴空泡明显较多（P<0.01），表明模型组肝脏脂滴含量较多、脂肪肝的状态较为严重；采用阳性药和还原型谷胱甘肽片治疗后，动物肝脏脂滴空泡数显著减少，相较与模型组肝脏炎症和脂肪肝的状态得以缓解，差异有统计学意义（P<0.01，P<0.05）。见图1 和表6。

4 讨论

酒精滥用和酒精依赖是当前世界面临的严重问题，而我国是全球酒精性肝损伤疾病人群最多的国家，严重危害了人民群众的健康。研究表明，酒精性肝损伤的发病因素和病变程度与基因、性别以及饮酒时间长短等诸多因素有关，其发病机制也较为复杂。乙醇进入机体后，在肝脏乙醛脱氢酶的作用下生成乙醛，此生成的乙醛能够通过激活肝脏中的一系列氧化酶系引起脂质过氧化而损伤肝脏细胞，使之造成肝脏脂质生成增加、脂滴积聚和慢性炎症反应[8，9]。

本研究结果表明，长期酒精摄入能够引起小鼠肝脏肿大，且伴随着动物血清ALT、AST、ALP 含量和脂质代谢异常相关的TC、TG、LDL-c 显著增加，HDL-c 明显降低，表明酒精性肝损伤动物模型构建成功。对模型小鼠肝脏中炎症因子TNF-α、HMGB-1、IL-6 表达水平检测发现，造模后动物炎症因子表达明显增加，表明了酒精性肝损伤能够导致肝脏炎症的产生。

表6 还原型谷胱甘肽片对酒精性肝损伤小鼠肝脏脂滴空泡数的影响（，n=10）

表6 还原型谷胱甘肽片对酒精性肝损伤小鼠肝脏脂滴空泡数的影响（，n=10）

采用还原型谷胱甘肽片治疗后，血清中ALT、AST、ALP 含量和脂质代谢异常相关的TC、TG、LDL-c 显著降低，HDL-c 显著增加，且其肝脏中的炎症因子和表达水平均显著降低，表明了还原性谷胱甘肽具有保护肝细胞、减少肝脏炎症的作用。过去的研究多聚焦于酒精能够增加肝脏氧化应激状态，活性氧自由基（ROS）的大量产生是酒精导致肝脏炎症损伤的重要机制，而忽略肝脏脂滴生成增加在肝脏损伤中的潜在作用。最新的研究表明，肝脏脂滴沉积[10]是脂肪肝的重要表现，严重影响肝脏功能，减少脂滴沉积是肝脏保护的手段和途径，也是研究的重要课题。

本研究对肝脏病理学切片观察发现，动物造模后，肝脏出现大量圆形脂滴孔空泡，而采用还原型谷胱甘肽片治疗后，动物肝脏中的圆形脂滴孔空泡、脂滴沉积得以缓解，表明还原型谷胱甘肽片可能通过减少脂滴沉积、发挥保护和治疗酒精性肝损伤的作用。

综上所述，本研究创新性的发现还原型谷胱甘肽片可能通过减少肝脏脂滴生成以及抑制肝脏炎症，发挥对小鼠酒精性肝损伤的保护作用。今后课题组将通过对肝脏中脂滴生成的相关信号通路进行研究，以期更深入地揭示还原型谷胱甘肽片保护酒精性肝损伤的作用机制。