一测多评法测定代代花中4 种二氢黄酮类成分

承 晨，顾峥嵘

常州市食品药品监督检验中心，常州213000

代代花为芸香科植物代代Citrus aurantium L.var.amara Engl.的干燥花蕾，又名枳壳花、酸橙花、香橙花，始载于《开宝本草》。主产于江苏、浙江等省。味苦、酸，归肝、胃经，具有行气宽中、消食、化痰的功能[1-3]。代代花中含有丰富的挥发油、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷等二氢黄酮类成分及N-甲基酪胺、辛弗林等生物碱类物质，并且黄酮类成分含量高于同科其他植物[4-6]。临床上二氢黄酮类成分如橙皮苷，由于其具有维持血管正常渗透压、降低血管脆性、缩短出血时间以及抗炎、抗病毒、预防冻伤等作用，被广泛应用于心血管疾病的辅助治疗。

一测多评法是利用中药中有效成分内在函数关系和比例关系，通过测定一个成分（性质稳定且易得到的对照品）而实现多个成分的同步测定。该方法能节约对照品，减少操作步骤[7-9]。代代花中柚皮苷对照品性质稳定、价格便宜且易得，而新橙皮苷、芸香柚皮苷价格昂贵。因此，本实验采用HPLC法同时测定了代代花中芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的含量，并采用一测多评的方法，根据上述4 种二氢黄酮类成分之间的函数关系和比例关系，以柚皮苷为内标物质，得到了柚皮苷与芸香柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷之间的相对校正因子（f），计算出这3 种二氢黄酮类成分的量，为代代花多指标定量测定与质量控制提供了全新的分析模式。

1 仪器与药品、试剂

1.1 仪器

Agilent 1200 型高效液相色谱仪（Agilent 有限公司）；LC-20A 高效液相色谱仪（日本岛津公司）；Waters e2695 高效液相色谱仪（美国沃特世公司）；3种色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（4.6×250 mm，5 μm），岛津Inertsil ODS-SP（4.6×250 mm，5 μm），Thermo Syncronis C18（4.6×250 mm，5 μm）；XP105DR 十万分之一电子天平（美国Mettler 公司）。

1.2 药品与试剂

对照品：柚皮苷（批号110722-201714，纯度93.4%），橙皮苷（批号110721-201617，纯度96.1%），新橙皮苷（批号111875-201703，纯度99.3%）均购于中国食品药品检定研究院；芸香柚皮苷（批号B21364，纯度≥98%）购于上海源叶生物科技有限公司。甲醇、乙腈为色谱纯（Merck 公司）；冰醋酸（国药集团化学试剂有限公司）；水为超纯水。

6 批代代花购于多个中药市场，批号分别定为：150629、141201、20130313、151014、20140410、150325，均经专家鉴定确认。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（4.6×250 mm，5 μm）；流动相：0.4%磷酸-乙腈（84∶16）；检测波长：283 nm；体积流量：1.0 mL·min-1；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷对照品适量，用50%甲醇制成混合对照品储备溶液（芸香柚皮苷0.05921mg·mL-1、柚皮苷1.074 10 mg·mL-1、橙皮苷0.10273mg·mL-1、新橙皮苷3.02666mg·mL-1）。精密吸取混合对照品储备溶液5 mL 至50 mL量瓶中，用50%甲醇稀释至刻度，摇匀，作为混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液制备

取代代花样品粉末，过筛（40 目）取0.1 g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，称重，加热回流1 h，放冷，加入50%甲醇补足减失的重量，摇匀，用0.45 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 系统适用性与专属性试验 取混合对照品、供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，结果见图1。

由图1 可见，芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷与相邻色谱峰的分离度均大于1.5，且均可通过DAD 纯度检测。各组分的理论塔板数均大于120 00，方法专属性良好。

2.4.2 线性关系考察 分别精密吸取“2.2”项下混合对照品储备溶液5、2、1、0.5、0.2、0.1 mL 于10 mL量瓶中，用50%甲醇稀释配制成系列浓度的混合对照品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，以峰面积为纵坐标（Y），对照品进样量（μg）为横坐标（X）绘制标准曲线，并进行线性回归，结果见表1。

2.4.3 进样精密度试验 精密吸取“2.2”项下混合对照品溶液（芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷浓度分别为5.921、107.410、10.273、302.66 μg·mL-1），按“2.1”项下的色谱条件进样测定，重复测定6 次，记录峰面积。结果芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷对照品的峰面积的RSD 分别为0.18%、0.08%、0.13%、0.09%。表明仪器精密度良好。

表1 4 种化学成分的线性关系考察结果

2.4.4 稳定性试验 取“2.3”项下供试品溶液（批号：151014）分别于配制后0、8、16、24、36、48 h 测定芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的峰面积，进样量为10 μL。结果4 种成分峰面积的RSD 分别为0.71%、0.50%、0.45%、0.36%。表明供试品溶液在48 h 内具有良好的稳定性。

2.4.5 重复性试验 取同一批次样品（批号：151014）6 份，分别按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下的色谱条件进样测定，以外标法进行计算，测得芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷含量（g/g）RSD 分别为1.10%、0.85%、0.81%、0.80%。表明方法重复性良好。

2.4.6 加样回收率试验 精密称取已知含量的代代花（批号：151014）50 mg，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，平行6 份；精密加入芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷浓度分别为4.934、53.70、10.27、151.3 μg·mL-1的混合对照品溶液25 mL 及50%甲醇25 mL，按“2.1”项下的色谱条件进行测定，计算加样回收率。结果表明，芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的平均回收率分别为96.89%、99.91%、97.09%、98.34%；RSD 分别为1.39%、1.15%、1.07%、1.18%。表明该方法的准确度良好。

2.5 相对校正因子f 的计算

2.5.1 待测成分f 的测定 精密吸取“2.2”项下混合对照品溶液（芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷浓度分别为5.921、107.410、10.273、302.66 μg·mL-1），分别进样1、2、4、6、8、10 μL，根据公式计算f。

fk/m=fk/fm=（Wm×Ak）/（Wk×Am）

Ak为内标物峰面积，Wk为内标物质量，Am为其他组分m 峰面积，Wm为其他组分m 质量。

以柚皮苷为内标物计算其它3 种成分的相对校正因子f，结果见表2。

2.5.2 不同仪器与色谱柱对f 的影响 考察了Agilent 1200、岛津LC-20A、Waters e2695 型3 种高效液相色谱系统和Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18、岛津Inertsil ODS-SP、Thermo Syncronis C183 种色谱柱。实验表明，各种条件下所得的RSD＜1.5%，f 在不同的高效液相色谱仪与不同品牌色谱柱间具有良好的适应性。见表3。

表2 以柚皮苷为内标物的3 种成分的相对校正因子

表3 不同仪器与色谱柱对相对校正因子的影响

2.5.3 不同体积流量对f 的影响 考察了体积流量为0.8、1.0、1.2 mL·min-1时对f 的影响，结果见表4。

表4 不同体积流量对相对校正因子的影响

2.5.4 不同柱温对f 的影响 考察了柱温为20、30、40 ℃时对f 的影响，结果见表5。

2.6 待测色谱峰的定位

在“2.1”项确定的色谱条件下，吸取“2.2”项下混合对照品溶液，进样量为10 μL，测定内标物质柚皮苷的相对保留值[rm/k=tR（m）/tR（k）]，根据rm/k即可正确判断目标峰芸香柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的峰位置。本研究测定了相对保留值在不同品牌仪器、不同色谱柱时的重现性，结果表明，各待测成分与相邻色谱峰的分离度均大于1.5，均可通过DAD 纯度检测，且相对保留值RSD 均小于5%，可用于待测成分色谱峰的定位。见表6。

表5 不同柱温对相对校正因子的影响

表6 不同仪器与色谱柱测得的相对保留时间

2.7 样品含量测定

按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下的色谱条件进样测定，进样量为10 μL，采用外标法对代代花中4 种化学成分进行含量测定，同时与一测多评法计算的结果作比较，两种方法所得结果无显著性差异。见表7。

表7 一测多评法与外标法测得有效成分量的比较（g·g-1，%）

3 讨论

3.1 因为柚皮苷价格低廉、性质稳定，故本实验选择柚皮苷为内标物进行一测多评分析。本实验通过对水、50%甲醇、70%甲醇、甲醇等溶剂的考察，发现使用50%的甲醇作为溶剂，样品的提取效率高，在对照品色谱图中，色谱峰峰形对称，理论塔板数高，分离效果好。通过考察超声、回流等不同提取方法以及提取时间选择，发现加入50%甲醇50 mL，加热回流1 h，效果最佳、提取充分。

3.2 在对代代花有效成分检测波长的选择上，对芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷作全波长扫描，由于4 种成分均属于二氢黄酮类，其紫外吸收峰相似，均在283 nm 左右有最大吸收，故选定该波长。

3.3 本实验采用HPLC 外标法测定代代花中柚皮苷的含量，同时测定并且计算出芸香柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的相对校正因子f，利用f 值计算得到了其含量，实现了代代花的一测多评。同时，采用外标法计算代代花中芸香柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的量，比较后发现外标法计算值与f 计算值之间没有显著性差异。

3.4 一测多评法是利用一种相对易得、廉价的内参物对照品，实现对多个成分的同时测定，最终达到控制中药整体质量的目的[7]。本实验只考察了一测多评法在同类成分间测定的可行性，其在不同类型化合物间定量测定的可行性仍需进一步研究。

3.5 代代花资源丰富，民间用其治疗胸腹满闷胀痛、胃部下垂、脱肛及妇科疾病，应用前景十分广阔。本研究利用一测多评法对代代花中的芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷进行含量测定，具有较高的重现性、稳定性以及可靠度，从而丰富了代代花的质量评价方法，为研究提供了新思路，有利于代代花的质量控制。