基于网络药理学探讨交泰丸治疗失眠的作用机制

洪曹栋，尹 嘉，张 萌，门九章，冯 明

失眠(insomnia)是全球普遍存在的睡眠障碍，给人们身心健康带来重大风险[1]。根据世界卫生组织(WHO)统计，全球睡眠障碍率达27%，在我国，成年人失眠发生率高达38.2%，超过3亿人有睡眠障碍，且这个数据仍在逐年攀升[2]。失眠已成为影响人们生活质量的重要因素之一，甚至可能诱发交通事故等意外而危及个人及公共安全，对个体和社会都构成严重的负担[3]。研究表明，失眠可以增加心血管代谢疾病的风险，包括血压的变化、心率变异性受损等，增加死亡率[4]。因此，通过有效防治失眠，对于预防心血管代谢疾病发生、发展至关重要。现代临床医学以药物治疗为主，虽然短期内有效，但存在依赖性和耐受性， 停药后疗效无法持续的弊端；而中医学治疗失眠方法多样，使用的方剂众多，但其现代药理作用机制尚不完全明确。因此，通过现代药理学的思路研究中药方剂的作用机制具有重要的意义[5]。中医学认为失眠的病机变化与心、肝、脾、肾关系密切，病机的表现形式主要有肝火扰心、痰热扰心、心脾两虚、心肾不交型。肾是人体之根本，心肾相交是人体正常的气机升降，若心肾不交即可表现出夜不能寐的病理症状。交泰丸是中医内科中治疗心肾不交型失眠的经典方剂。通过前期的研究发现，交泰丸的现代药物成分复杂、靶点众多，其作用机制尚不明确。因此，本研究利用网络药理学方法，建立交泰丸-成分-靶点-失眠症交互作用网络，诠释交泰丸治疗失眠的可能作用机制，为失眠的防治提供新的治疗方法。

1 资料与方法

1.1 数据来源 本研究采用中药系统药理学分析平台TCMSP数据库(http://tcmspw.com/tcmsp.php)，Batman数据库(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)，Swiss Target Prediction数据库(http://www.swisstargetprediction.ch/)，Gene Cards数据库 (https://www.genecards.org/)，STRING数据库(https://string-db.org/)，Venny 2.1在线软件作图工具平台(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)，Uniprot数据库(https://www.uniprot.org/)，Cytoscape 3.7.1软件，R 3.6.0软件等。

1.2 研究方法

1.2.1 交泰丸活性成分与潜在靶点筛选 使用TCMSP、Batman数据库检索交泰丸中的黄连、肉桂2味中药，并结合文献收集药物的化学成分及靶点信息，使用Uniprot数据库，将靶点名称进行矫正统一，并使用Swiss Target Prediction数据库对靶点信息进行补充。

1.2.2 失眠疾病作用靶点筛选 使用Gene Cards数据库以“失眠”为关键词进行检索，获得疾病作用靶点，得到失眠的相关基因和靶点蛋白。与交泰丸潜在作用靶点相映射，得到交泰丸治疗失眠的潜在靶点。 Gene Cards数据库又称为“人类基因数据库”，是一个可搜索的集成数据库，可提供有关所有带注释和预测的人类基因的全面、用户友好的信息，包括基因组、转录组学、蛋白质组学、遗传、临床和功能信息[6]。

1.2.3 药物-疾病共同靶点的筛选 在Venny 2.1在线软件作图工具平台上分别录入黄连、肉桂与失眠症的靶点，绘制韦恩图，得到药物与疾病的共同靶点。

1.2.4 网络模型的构建及分析 使用Cytoscape 3.7.1软件，构建“药物-成分-疾病-靶点”相互作用网络图，使用Network Analyzer功能对中药复方的主要活性成分进行分析。

1.2.5 构建蛋白相关作用关系(PPI)网络图 将交泰丸-失眠疾病共同靶点输入到STRING数据库中进行检索，选取置信度分数(minimum required interaction score)>0.4作为筛选条件，构建蛋白相互作用的PPI网络，并根据蛋白之间的关联度进行排序。

1.2.6 通路富集分析 在R软件安装Bioconductor软件包“org.Hs.eg.db”并运行，将药物-疾病共同靶点转换成entrezID。然后在R软件安装“clusterProfiler”包，根据已转换的entrezID，以P<0.05，Q<0.05进行关键靶基因的基因本体论(GO)与京都基因和基因组百科全书(KEGG)功能富集分析，并将结果以条形图和气泡图形式输出。

2 结 果

2.1 交泰丸的潜在活性成分 通过在TCMSP、Batman数据库中检索交泰丸中黄连、肉桂2味中药的全部化学成分，根据在TCMSP数据库中设定生物利用度(OB)≥30%、药物相似性(DL)≥0.18，在Batman数据库中设定Score cutoff≥20%，对黄连、肉桂的有效成分进行筛选，结合文献[7]补充纳入药根碱，共得到有效活性成分34个，根据OB值排列前20位的活性成分信息见表1。其中黄连有15个有效活性成分，肉桂有19个有效活性成分，将活性成分对应的靶点输入UniProt数据库，并使用Swiss Target Prediction数据库对靶点信息进行补充，删除去重，共筛选出498个药物靶点。

表1 复方中OB值前20位的活性成分基本信息

2.2 失眠疾病作用靶点筛选 以“失眠”为关键词在Gene Cards数据库进行检索，去重后共获得疾病靶点2 279个。

2.3 药物-疾病共同靶点的筛选 在Venny 2.1在线软件作图工具平台上输入498个药物靶点、2 279个疾病靶点，绘制韦恩图，取交集后获得药物-疾病共同靶点160个(见图1)，其中黄连73个，肉桂108个，黄连-肉桂与失眠症共同靶点基因21个(见图2)。结果提示，交泰丸2味药可能通过共同靶点的协调作用发挥治疗失眠症的效果。

图1 交泰丸-失眠共同基因靶点数

图2 黄连-肉桂与失眠症靶点韦恩图

2.4 药物-成分-靶点-疾病相互作用网络模型的构建及分析 将中药复方中34个潜在活性成分与160个药物-疾病共同靶点输入Cytoscape软件中，绘制出“药物-成分-靶点-疾病”相互作用的网络图(见图3)。图中紫色代表药物，蓝色代表交泰丸中的25种活性成分(9个活性成分靶点与疾病靶点无交集，予删除)，绿色代表160个共同靶点，红色代表疾病。Degree值表示预测出该成分与作用靶点的关联个数，Degree值越大说明该成分越重要，使用Network Analyzer对网络图进行分析显示：其中作用靶点数量Degree值>10的化合物有10个，分别为槲皮素(quercetin)61个、苯乙烯(Styrene)60个、苯甲酸肉桂酯(Cinnamyl Benzoate)21个、乙酸肉桂酯(Cinnamyl Acetate)21个、(R)-氢化小檗碱[(R)-Canadine]14个、茴香脑(Anethole)13个、反肉桂酸(Trans-Cinnamic Acid)12个、肉桂酸乙酯(Ethylcinnamate)12个、肉桂酸(Cinnamic Acid)12个、肉桂醛(Cinnamic Aldehyde)10个，这些化合物能与10个以上靶点链接，可能是交泰丸中治疗失眠的主要活性成分。此外，靶点人β2肾上腺素能受体(ADRB2)13个、前列环素G/H合酶和环氧合酶(PTGS1)12个、雄激素受体(AR)10个，与成分链接次数>10次，这说明ADRB2、PTGS1、AR可能是交泰丸治疗失眠的重要靶点；而雌激素受体1(ESR1)、肾上腺素受体1B(ADRA1B)、白介素-1β(IL-1β)、肾上腺素受体2C(ADRA2C)、肾上腺素受体1A(ADRA1A)、γ-氨基丁酸A型受体alpha-1(GABRA1)的链接次数>5次，表明这些靶点在失眠的治疗中可能也发挥一定的作用。说明交泰丸治疗失眠的机制是非常复杂的。

图3 药物-成分-靶点-疾病相互作用的网络图

2.5 PPI关系网络分析 在STRING数据库中录入上述160个药物-疾病共同靶点，分析得到蛋白相互作用的PPI网络(见图4)，每条边代表蛋白与蛋白之间的相互作用关系，线条越多代表关联度越大，得到PPI图中的靶点排序(排名前30位)，见图5。表明这些蛋白在PPI网络中具有重要的地位，对于交泰丸治疗失眠具有重要的临床意义。通过PPI网络中关键靶点相互映射，可推测交泰丸的有效成分可能通过胰岛素(INS)、白介素-6(IL-6)、IL-1β、肿瘤坏死因子(TNF)、血管内皮生长因子A(VEGFA)等靶点发挥治疗作用。

图4 靶点相互作用PPI图

图5 PPI图中的靶点排序(排名前30位)

2.6 GO富集分析 将160个药物-疾病共同靶点经R语言运行后GO分析选取生物学过程、细胞组分及分子功能3个部分。结果显示，交集基因集合共富集至2 076条生物学过程(BP)通路中，其中，富集基因数目>20个的数目为78条，主要与第二信使介导的信号传递(second-messenger-mediated signaling)，G蛋白偶联受体信号传导途径、与环状核苷酸第二信使偶联(G protein-coupled receptor signaling pathway，coupled to cyclic nucleotide second messenger)，对细菌起源分子的反应(response to molecule of bacterial origin)，调节膜电位(regulation of membrane potential)，调节炎症反应(regulation of inflammatory response)，肽分泌的调节(regulation of peptide secretion)，对脂多糖的反应(response to lipopolysaccharide)，循环系统中的血管过程(vascular process in circulatory system)等生物过程相关，表明交泰丸可能通过多个生物学过程发挥治疗作用。详见图6。

图6 交泰丸治疗失眠症的GO富集分析

2.7 KEGG富集分析 将160个药物-疾病共同靶点经R语言运行后共得到106条KEGG通路，前20位的结果形成KEGG功能富集的条形图，P代表富集的显著性，颜色越红则显著性越高。结果显示，共同靶点主要富集于Toll样受体信号通路(Toll-like receptor signaling pathway)、NF-κB信号通路(NF-kappa B signaling pathway)、环磷酸腺苷(cAMP)信号通路(cAMP signaling pathway)、γ-氨基丁酸(GABA)能突触(GABAergic synapse)、TNF信号通路(TNF signaling pathway)、胰岛素抵抗(Insulin resistance)、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路(MAPK signaling pathway)、环磷酸鸟苷-蛋白激酶(cGMP-PKG)信号通路(cGMP-PKG signaling pathway)等通路。表明交泰丸的活性成分靶点分布于不同的通路，可能通过多个通路协同发挥作用。详见图7。

图7 交泰丸治疗失眠症的KEGG富集分析

3 讨 论

3.1 交泰丸的组方分析 交泰丸是中医经典方剂，配伍精妙，出自清代王孟英《四科简效方》，用于治疗“心肾不交，怔忡无寐”，是临床治疗失眠常用方剂。中医认为肾是人体之根本，心肾相交是人体正常的气机升降，若肾阴亏虚，肾精不能上济于心，心火不能下交于肾，则会出现病理的心肾不交证，水火不能相济，使阳不入阴，阴不制阳，出现心神失养，夜不能寐，神志不安。交泰丸是治疗心肾不交型失眠的经典方剂，由黄连和肉桂两味药物组成，黄连可清心之上浮之火，肉桂引心火下入于肾，使心肾相交，故能寐，现代常用于治疗更年期失眠、顽固性失眠、抑郁性失眠[8-9]。按照中医证型分类用于治疗心肾不交型与阴虚火旺型失眠[10-11]。

3.2 交泰丸成分分析 通过分析得出交泰丸治疗失眠的有效成分有10个，包括槲皮素、苯甲酸肉桂酯、乙酸肉桂酯、(R)-氢化小檗碱、茴香脑、反肉桂酸、肉桂酸乙酯、肉桂酸、肉桂醛等。其中槲皮素属于黄酮类化合物，是交泰丸的主要活性成分。黄酮类化合物是一类低分子天然植物成分，大量实验研究表明，黄酮类化合物有抗氧化、抗炎、镇痛、调节免疫、抗衰老、降血脂作用，其作用机制可能与其抗自由基或抗氧化有关[12]。近年来黄酮类化合物对神经系统作用的研究成为热点。有研究报道，黄酮类化合物可通过多种受体和信号通路对中枢神经系统发挥作用，机制十分复杂，具有抗抑郁、抗焦虑、中枢神经抑制、治疗精神分裂症、保护神经系统、镇痛、改善记忆力和影响神经内分泌等多方面作用[13-16]。已有研究显示，槲皮素具有抗癌、抗氧化、抗纤维化、抗炎、抗菌、抗衰老、抗抑郁症、抗白血病、抗糖尿病等多种生物活性[17]。

现代药理学研究表明，在交泰丸合方中，肉桂的肉桂醛(桂皮醛)具有镇静催眠、抑菌、镇痛、扩管等多种功效；肉桂酸具有抗炎、升高白细胞、利胆、明显对抗由二磷酸腺苷(ADP)和胶原诱导的血小板聚集等药理作用[18]。黄连中的盐酸小檗碱具有抗菌、降压、扩张冠状动脉及兴奋平滑肌等作用[19]。小檗碱亦称黄连素，是从中药黄连中分离的主要有效成分。研究表明，黄连素对心血管系统具有调节蛋白激酶保护心肌、改善心肌缺血[20]、抑制血小板聚集[21]、调节钙离子保护心肌[22]作用，尤其是降血脂作用对防治动脉粥样硬化效果良好；对于神经系统具有促神经组织修复的作用，能够通过影响大脑内神经递质来达到抗焦虑作用[23-24]。以上实验研究数据说明了本研究的可行性，但还有很多未被研究或证实，需进一步深入研究。因此，该方对于失眠的防治具有重要的作用，能够缓解安眠药带来的不良反应和长期的依赖性，对进一步探讨其治疗失眠的机制具有非常重要的意义。

3.3 关键靶点分析 通过对交泰丸蛋白相关作用PPI关系网络分析可以发现，交泰丸的有效成分可能通过INS、IL-6、IL-1β、TNF、VEGFA等重要靶点发挥治疗作用，其中有96个化合物通过INS起作用。有研究表明，交泰丸具有改善睡眠、炎症和胰岛素敏感性的有益作用。其中INS敏感性与睡眠有着密切的关系[25]。失眠病人经常服用镇静催眠药、抗精神病药、抗抑郁药和抗焦虑药。与这些药物有关的异常长睡眠时间可能引起胰岛素抵抗的高风险，而慢性失眠通常与胰岛素抵抗有关，交泰丸干预后可以使胰岛素抵抗减弱。另有研究表明，失眠与某些炎症基因表达的调节有关，如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-1β和IL-6，交泰丸对于减轻大鼠的睡眠丧失相关炎症具有有益的作用[26]。TNF是公认的对神经元有损伤作用的细胞因子之一，在正常脑组织中呈节律性表达，参与了睡眠生理调节作用。近年来研究发现，许多免疫调节物质均参与了睡眠的调节过程，如细胞免疫。有研究发现，TNF可以延长非快速动眼睡眠期的时间，减少快速动眼睡眠期的时间；当TNF含量超过一定量时，则抑制正常睡眠。可能是通过协同其他炎症因子如IL-1β、IL-6等来改变神经内分泌的活动，增加某些神经递质的释放，引起大脑不同区域基因的激活，来维持人类自身基本的活动，如摄食、睡眠、学习和记忆等活动[27]。而当这一平衡遭到破坏时，就可能出现如睡眠障碍、学习记忆能力下降等日常生活紊乱[28]。亦有很多研究表明，睡眠剥夺与血管内皮生长因子(VEGF)的变化有密切关系[29]，缺氧是VEGF水平升高的主要刺激因素，与心血管疾病的发生有关。睡眠呼吸暂停病人血液循环中的VEGF浓度升高，其升高的原因是由于合并心血管疾病或动脉粥样硬化的亚临床症状引起的，而不是由于呼吸系统疾病和低氧本身造成的，因此，降低VEGF浓度，对改善睡眠质量具有临床意义[30]。说明交泰丸可能通过调节上述主要基因靶点的表达，从而改善失眠引发的胰岛素敏感性、免疫反应，进一步达到改善症状的目的。

3.4 通路结果分析 KEGG通路分析结果可见，交泰丸有较多基因靶点富集在与炎症相关的疾病和信号通路，这说明交泰丸可能通过作用于这些炎症因子靶点，调节炎症信号通路，抑制炎症反应，改善胰岛素抵抗，从而发挥治疗失眠的作用。其中Toll样受体信号通路、NF-κB信号通路、TNF信号通路都属于炎症相关通路，说明失眠与以炎症为特征的疾病状态有关。

目前研究表明，Toll样受体信号通路中的Toll样受体4(TLR4信号通路)响应已知与睡眠丧失相关的内源性和病原体相关配体而激活炎症信号级联反应，因此，TLR4可能是某些与炎症相关的睡眠丧失影响的介质，越来越多的证据在评估TLR4作为睡眠剥夺细胞促炎反应介质的作用研究中，已经提供了令人信服的理由[31]。Toll样受体对获得性免疫应答类型具有调控作用，TLR4具有活化诱导免疫细胞合成和促炎细胞因子(TNF、IL-6及IL-1β)释放的作用[32]。证明了TLR4及其在睡眠调节中激活的细胞内信号通路的重要性。

已有研究证明，睡眠与免疫力之间的相互作用，构成人体睡眠剥夺的主要组成部分是免疫功能基因，NF-κB是一种重要的转录信号因子，可调节多种免疫与炎症相关的基因表达[33]，在睡眠缺失情况下其在机体的水平明显升高，NF-κB信号通路的下游成分，尤其是细胞因子[白介素-2(IL-2)、IL-6]对睡眠有重要的影响[34-35]。有研究发现，IL-2 和IL-6 作为细胞因子参与人体的睡眠和免疫功能的调节过程，慢性失眠常引起机体的慢性炎性反应以及免疫功能变化，而改变机体IL-2 和IL-6的分泌水平对失眠有重要调控作用[36]。

研究表明，睡眠剥夺会损害海马cAMP信号传导，并且cAMP传导的失调与睡眠丧失具有重要作用[37]。睡眠剥夺过程中海马兴奋性神经元中瞬时增加的cAMP水平足以防止因睡眠丧失而导致的记忆巩固不足。另外，睡眠剥夺会降低基础条件下海马中cAMP反应元件结合蛋白(CREB)的磷酸化，并防止CREB磷酸化[38]。

其次，TNF也是免疫系统重要的细胞因子，除参与炎症反应外，还参与机体其他生理功能的调节，如影响睡眠、脑发育、食欲和内分泌功能等。脑内TNF的表达受到微生物代谢产物及昼夜节律的影响，动物血中单核细胞产生TNF的能力与睡眠-觉醒周期有关。TNF静脉注射或脑室注入，可延长家兔、大鼠、小鼠的非快速眼动睡眠时间，说明TNF参与非快速眼动睡眠的调节。进一步研究发现，TNF可能通过促进大鼠、小鼠脑内5-羟色胺(5-HT)的合成而调节睡眠[39]。

另外GABA是中枢神经系统的主要抑制性神经递质，对神经系统的神经元具有普遍的抑制作用，在兴奋-抑制调节中起重要作用，具有抗焦虑、抗惊厥、镇痛、调节内分泌等功能[40]。脑中GABA是通过谷氨酸经谷氦酸脱梭酶脱竣而成。GABA可存在于神经末梢胞浆，也可贮存在突触囊胞中。GABA神经元兴奋时，GABA被神经末梢释放到突触间隙，主要依靠突触前膜的摄取，胶质细胞也可摄取GABA。用免疫组化技术显示脑内GABA的分布，结果显示，大脑中广泛存在GABA能神经元，绝大多数都是短轴突中间神经元，主要分布在大脑皮层、海马和小脑。黑质是脑中GABA浓度最高的脑区[41]。 有研究揭示，不同脑区的GABA、谷氨酸含量及其受体功能的改变参与睡眠觉醒过程及不同睡眠时相的转换，在睡眠调节中发挥重要作用[42]。GABA含量的增加对兴奋性和抑制性传导的平衡起着关键作用，进而间接导致对睡眠产生特殊影响，目前已经公认的是GABA受体的活化有利于睡眠[43]。

目前研究已经明确，以上通路具有调节睡眠的作用，说明交泰丸有可能通过Toll样受体信号通路、NF-κB信号通路、TNF信号通路、cAMP信号通路等，来抑制炎症因子的产生，从而达到治疗失眠的作用。

有学者研究了睡眠呼吸障碍与胰岛素抵抗之间的关系，发现睡眠呼吸障碍对胰岛素抵抗具有独立的不良影响[44]。而失眠病人长期服用镇静催眠、抗精神病、抗抑郁和抗焦虑等药物可能引起胰岛素抵抗的高风险，特别是慢性失眠通常与胰岛素抵抗有关，交泰丸干预后可能使胰岛素抵抗减弱。

综上所述，结合网络药理学的数据分析，可以推测交泰丸可能通过调节炎症通路干预炎症的发生发展以及改善胰岛素抵抗来发挥治疗失眠的作用，交泰丸可能通过作用于INS、VEGFA以及炎性细胞因子如TNF、IL-1β和IL-6等多个靶点，调节Toll样受体信号通路、NF-κB信号通路、cAMP信号通路、GABA能突触、TNF信号通路、胰岛素抵抗等，作为研究交泰丸治疗失眠分子作用机制的思路。本研究基于网络药理学深入探讨交泰丸的作用机制，为交泰丸治疗失眠提供新的思路和方法，也为交泰丸的临床应用提供了参考价值。