中药抗高原病方的抗缺氧效能及其机制研究

高原反应是指短期内由平原进入高原，或由低海拔地区进入到高海拔地区时，由于对低氧环境的适应能力不全或失调而发生脑肺综合征[1]。正常人进入高原后，会因为高原低压低氧的环境而导致缺氧，会出现头痛、头晕、心悸、胸闷、睡眠障碍、恶心、呕吐等临床症状。这些高原反应严重影响了正常人的工作和生活，更严重影响了我军行军速度与作战能力[2]。因此，积极采取措施预防和治疗机体缺氧，对高原反应的防治有举足轻重的作用。国外常使用利尿药、肾上腺皮质激素、醋氮酰胺等药物防治高原病，但疗效不理想，且有一定的不良反应[3-4]。中药大多由天然植物组成，安全性较好，近年来中药用于急性高原反应防治的研究也有了很大的进展。本研究的 “抗高原病方”是由8味中药材组成，是根据经典名方“丹参饮”经过几代中医的临床经验，在实践中不断改进的中药复方。此药方中丹参具有活血化瘀，养血安神的功效，为君药；三七助丹参活血化瘀，西洋参益气养阴，红花活血定痛，共为臣药；砂仁、檀香行气止痛，山楂消食和胃，共为佐药；冰片开窍醒脑，并引诸药上达颠顶，以止头痛，为使药。本研究通过小鼠密闭缺氧实验来评价抗高原病方的抗缺氧能力及其机制研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 雄性昆明小鼠（KM小鼠），SPF级，体质量18～20 g，购自北京科宇动物养殖中心，动物合格证号：SCXK（京）2018-0010。恒温、恒湿标准条件下饲喂、自由饮水并自动控制昼夜节律。

1.1.2 药物与试剂 抗高原病方由空军特色医学中心自制国，红景天购自四川省佳汇泰生物科技开发有限公司，丙二醛（malondialdehyde，MDA）测试盒（20190510）、总超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）测试盒（20190327）、谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）测试盒（20190321）、过氧化氢酶（catalase，CAT）测试盒（20190304）、过氧化氢（H2O2）测试盒（20190516）、乳酸（lactic acid，LD）测试盒（20190522）均购自南京建成生物工程研究所有限公司。

1.1.3 仪器 小鼠密闭缺氧瓶（装有约5 g钠石灰的125 ml广口瓶以橡皮塞密闭，空军特色医学中心自制）；PL-203电子天平购自梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；KH-Ⅲ全自动研磨仪和MX-F涡旋混合器均购自武汉赛维尔生物科技有限公司；JY92-Ⅱn 超声细胞粉碎机购自宁波新芝生物科技股份有限公司；Neofuge 15R台式高速冷冻离心 机购自力康生物医疗科技控股有限公司；Epoch酶标检测仪购自美国伯腾仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 密闭缺氧实验 将72只雄性小鼠适应性喂养1周后，按照体质量随机分成6组，各组灌胃给药1次/d。对照组及缺氧模型组给予等体积生理盐水，红景天组剂量为0.078 g/（kg·d），抗高原病方低、中、高剂量分别为0.78 g/kg、1.56 g/kg、3.12 g/kg。连续给药15 d后，除对照组外将其余小鼠单个置于装有约5 g钠石灰的125 ml广口瓶中，以橡皮塞密闭，密切观察记录动物死亡时间。依照实验组与对照组动物存活时间（min），并对组间结果进行方差分析。

1.2.2 生化指标测定 完成缺氧密闭实验后，取小鼠脑组织和心脏组织，置-80 ℃冰箱中保存。将组织样本制成10%组织匀浆，运用试剂盒检测组织中MDA、LD、H2O2、SOD、GSH-Px、乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）和CAT的含量。

1.3 统计学处理应用SPSS 21.0软件对数据进行统计分析，计量资料以±s表示，组间比较采用SNK-q检验，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 抗高原病方对小鼠体质量的影响分别在第1、8、15天测定小鼠的体质量，结果显示各组小鼠体质量均呈增加趋势。与对照组比较，抗高原病方低、中、高剂量组对小鼠体质量均差异无统计学意义（P＞0.05），而红景天组小鼠体质量均增加（P＜0.05）（表1）。

表1 抗高原病方对小鼠体质量的影响（n=12）

2.2 抗高原病方对小鼠抗缺氧能力的影响与缺氧模型组比较，红景天组小鼠存活时间差异无统计学意义，而抗高原病方低、中、高剂量组小鼠存活时间增加，小鼠存活时间分别增加了14.45%、21.62%、44.84%，表明抗高原病方能够显著提高小鼠抗缺氧能力；与红景天组比较，抗高原病方低、中、高剂量组小鼠存活时间增加，差异均具有统计学意义（P＞0.05），表明抗高原病方抗缺氧能力显著优于红景天（表2）。

表2 抗高原病方对小鼠在密闭缺氧条件下存活时间的影响（n=12）

2.3 抗高原病方对缺氧小鼠心脏和脑组织中MDA、GSH-Px和SOD的影响与对照组比较，缺氧模型组、红景天组和抗高原病方组小鼠心脏组织中MDA水平均显著升高，并在抗高原病组中随着给药剂量的增加而不断增加；同时GSH-Px和SOD的含量也增加（P＜0.05）。与缺氧模型组比较，红景天组和抗高原病方中、高剂量组小鼠心脏组织中MDA的含量显著增加，GSH-Px和SOD的含量仅在抗高原病方组中显著增加，差异有统计学意义（表3）。与对照组比较，缺氧模型组、红景天组和抗高原病方组小鼠脑组织中MDA水平均显著升高，并且抗高原病方组中MDA的含量随着抗高原病方的剂量的增加而降低；小鼠脑组织中GSHPx的含量仅在抗高原病方低、中剂量组以及红景天组显著增加，而SOD的含量在抗缺氧模型组、红景天组以及抗高原病方低、中剂量组显著增加。与缺氧模型组比较，红景天组和抗高原病方组小鼠脑组织中MDA的含量均显著增加，GSH-Px的含量在抗高原病方低、中剂量组以及红景天组显著增加，而SOD的含量仅在抗高原病方低、中剂量组显著增加（表4）。

表3 抗高原病方对小鼠心脏组织中MDA、GSH-Px和SOD的影响（n=12）

表4 抗高原病方对小鼠脑组织中MDA、GSH-Px和SOD的影响（n=12）

2.4 抗高原病方对缺氧小鼠心脏和脑组织中H2O2和CAT的影响与对照组比较，缺氧模型组、红景天组和抗高原病方组小鼠心脏组织中H2O2水平均升高（P＜0.05），而CAT的含量在抗高原病方组中升高。与缺氧模型组比较，小鼠脑组织中CAT的含量在红景天组和抗高原病方高剂量组中显著升高，而H2O2的水平有一定程度的升高但差异无统计学意义（表5）。

表5 抗高原病方对小鼠心脏组织中H2O2和CAT的影响（n=12）

与缺氧模型组比较，小鼠脑组织中H2O2的含量在缺氧模型组、红景天组和抗高原病方组中较对照组均升高，并且在抗高原病方组中其含量随着抗高原病方的剂量的增加而降低；而CAT的含量仅在缺氧模型组中升高；与缺氧模型组比较，H2O2的含量在抗高原病方低剂量组中显著升高（P＜0.01），CAT的含量在红景天组和抗高原病方中、高剂量组中降低（P＜0.05）（表6）。

表6 抗高原病方对小鼠脑组织中H2O2和CAT的影响（n=12）

2.5 抗高原病方对缺氧小鼠心脏和脑组织中LD和LDH的影响与对照组比较，乳酸的含量仅在抗高原病方高剂量组小鼠心脏组织以及抗高原病方低剂量组脑组织中升高（P＜0.05），与缺氧模型组比较，乳酸的含量仅在抗高原病方低剂量组中显著升高（P＜0.01），而乳酸脱氢酶仅在小鼠脑组织中检测到，且仅在红景天组中升高（P＜0.05）（表7）。

表7 抗高原病方对小鼠心脏和脑组织中LD和LDH的影响（n=12）

3 讨论

高原环境的特点是低压缺氧，未经习服人员快速从平原进入高原地区时，往往会出现头痛、恶心、肠胃不适、睡眠不佳等急性高原病症状[5]。急性高原病是危害急进高原人群健康的常见疾病，严重时可发展为高原脑水肿，危及生命[6]。目前，乙酰唑胺是目前国际上公认预防急性高原病的药物，是美国食品药品监督管理局批准的该适应证的唯一药物[7]，但由于其可引起四肢及面部麻木感、嗜睡、多尿、口渴、耳鸣和胃肠道不适等，甚至导致肾衰等不良反应，限制其广泛使用[8]。因此，积极研究寻找新的高效、安全的预防急性高原病的药物是当前高原医学研究的重点之一。本研究中抗高原病方是根据经典名方“丹参饮”经过几代中医的临床经验，在实践中不断改进，经过理论研究的可行药方。本研究通过小鼠密闭缺氧实验发现抗高原病方能够剂量依赖性地显著延长小鼠的存活时间，其作用显著优于红景天，表明抗高原病方确实能够增强小鼠的抗缺氧能力。

低压缺氧诱导的氧化应激会对机体多个器官造成损伤，特别是脑组织[9]。大脑组织耗氧量大，含有高浓度的不饱和脂肪酸以及丰富的金属离子，同时抗氧化酶的含量较低，这些因素使其对高原缺氧造成的氧化应激非常敏感[10-11]。有研究表明，低压缺氧条件下会严重影响脑组织结构和功能，特别是神经认知功能和空间记忆能力[11-14]。虽然低压低氧导致脑损伤的机制尚不完全明确，但是目前公认过度的反应氧蓄积是造成损伤的最重要原因之一。因此，该研究中对抗高原病方对小鼠心脏以及脑组织中MDA、H2O2、GSHPx、SOD和CAT氧化应激等相关指标进行检测，来揭示其改善小鼠抗缺氧能力的作用机制。研究结果显示，在缺氧条件下，小鼠心脏以及脑组织中氧化应激的标志物丙二醛的含量显著增加，表明当小鼠暴露于低氧条件下心脏和脑组织的氧化应激明显增加，并且随着缺氧时间的延长而逐渐增加，这一结果与其他研究一致[15-17]。同时随着氧化应激水平的提高，小鼠心脏和脑组织中抗氧化酶（例如SOD和GSH-Px的含量也显著增加，尤其抗高原病方能够急剧增加心脏组织中SOD的含量。此外，本研究发现随着缺氧会导致心脏和脑组织中H2O2的积累，但随着抗高原病方剂量的增加H2O2的含量而逐渐降低。因此推断抗高原病方可通过改善缺氧所导致的氧化应激生成和抗氧化剂保护之间的不平衡，从而降低对生物分子的氧化损伤，进而提高小鼠的抗缺氧能力。

大脑作为机体代谢最活跃的器官，对缺氧更加敏感，该研究中缺氧条件下小鼠脑组织中乳酸和乳酸脱氢酶的含量显著增加，说明脑组织中糖酵解作用增强，有氧氧化过程受抑制，能量供应障碍[17]，而抗高原病方随着剂量的增加其抗缺氧能力增加，同时会改善LD及LDH在脑组织中的积累。

综上所述，该研究证明了抗高原病方能够显著提高小鼠的抗缺氧效能，其作用主要是通过改善缺氧所导致的氧化应激损伤和抗氧化保护之间的平衡，激活其抗氧化防御能力，对氧化应激做出有效的适应性反应，同时改善机体在缺氧条件下能量的代谢障碍。