液相色谱法测定果汁饮料中甜蜜素的不确定度评定

裴波 何殷萍 欧敏先

绵阳市食品药品检验所 四川绵阳 621000

环己基氨基磺酸钠，俗称甜蜜素。它是食品生产中常用的一种人工合成的无营养性食品甜味剂。甜蜜素的甜味纯正，甜度是蔗糖的30～40倍，由于甜度高、价格低廉等优势，曾被多国广泛使用[1]。甜蜜素因长期存在是否具有致癌性的争议，美国、日本等国家已不允许在食品中添加甜蜜素[2]。在我国，甜蜜素仍普遍使用于食品加工行业，并且在GB 2760-2014《食品安全国家标准 食品添加剂使用标准》中对甜蜜素的使用范围和最大使用量都有明确规定，其中果汁饮料中甜蜜素（以环己基氨基磺酸计）的最大使用量为0.65g/kg[3]。

目前，在国家标准GB 5009.97-2016《食品安全国家标准 食品中环己基氨基磺酸钠的测定》中[4]，液相色谱法测定甜蜜素操作较繁琐，引起测定结果不确定度因素较多，根据我国国家质量技术监督局颁布的国家计量技术规范《JJF1059-1999测量不确定度评定与表示》[5]和国际ISO出版的“测量不确定度表示导则”。本文对液相色谱法测定果汁饮料中甜蜜素含量的不确定度来源进行分析。

1 实验

本文采用GB 5009.97-2016《食品安全国家标准 食品中环己基氨基磺酸钠的测定》标准中第二法——高效液相色谱法进行测定。

1.1 实验仪器及试剂

1.1.1 仪器

高效液相色谱（LC-20AT 岛津），配有紫外检测器或二极管阵列检测器；分析天平（JJ500 常熟市双杰测试仪器厂）。

1.1.2 试剂

环己基氨基磺酸钠（纯度≥99%）；正庚烷（色谱纯）；乙腈（色谱纯）；硫酸（分析纯）；次氯酸钠（分析纯）；碳酸氢钠（分析纯）；水为GB/T 6682规定的一级水。

1.2 色谱条件

色谱柱：C18柱，5μm，4.6mm×250mm；

流动相：乙腈+水（70+30）；

流速：1mL/min；

进样量：10μL；

柱温：40℃；

检测器：二极管阵列检测器；

检测波长：314nm。

1.3 样品处理

称取果汁饮料25.0g，用水定容至50mL备用。准确移取10.00mL备用液，加入2.00mL硫酸（1+1）溶液，5.00mL正庚烷和1.00mL次氯酸钠溶液，剧烈振荡1min，静置分层，除去水层后在正庚烷层中加入25.00mL碳酸氢钠（50g.L-1）溶液，振荡1min，静置取上层有机相，并经0.45μm微孔有机相滤膜过滤，上机测定[1]。

1.4 标准曲线

分别移取1.00mg/mL环己基氨基磺酸钠标准溶液0.50 mL，1.00 mL，2.50 mL，5.00 mL，10.00mL 至 50mL 容量瓶中，用水定容。移取10.00mL环己基氨基磺酸钠标准系列工作液，加入2.00mL硫酸（1+1）溶液，然后同1.3进行处理。

2 数学模型

2.1 数据采集计算转化过程

（1）以标准工作溶液的浓度为横坐标，以环己基氨基磺酸钠衍生物N，N-二氯环己胺峰面积为纵坐标，绘制标准曲线。利用校准直线回归方程计算样品中甜蜜素的含量。回归方程表示如下：

式中：

y——环己基氨基磺酸钠衍生物N，N-二氯环己胺峰面积；

a——回归方程的截距；

b——回归方程的斜率；

x——目标组分的浓度，单位μg.ml-1。

（2）利用式2计算样品中甜蜜素的含量。

式中：

X——试样中环己基氨基磺酸钠的含量，单位为克每千克（g.kg-1）；

C——由标准曲线计算出试样定容溶液中环己基氨基磺酸钠的浓度，单位为微克每毫升（μg.mL-1）；

V——试样的最后定容体积，单位为毫升（mL）；

m——试样的质量，单位为克（g）；

1000——由μg.g-1换算成g.kg-1的换算因子。

不确定度分量分析及评定

2.2.1 样品前处理的测量不确定度urel

2.2.1.1 分析天平的测量不确定度urel1

(1)分析天平示值误差引入的测量不确定度urel1-1

校准证书给出分析天平的允许误差限为0.05g，用均匀分布计算，包含因子为√3。每个样品，使用电子天平称量的次数为4次，称量过程都是相互独立的，因而称量过程的合成标准不确定度公式：

(n为不确定度分量的个数)计算。

相 对 不 确 定 度 uare1l-1= u1/m×100=0.228%。（ 质 量m=25.00g）

（2）分析天平的偏载误差引入的测量不确定度urel1-2

校准证书给出天平偏载允许误差限为0.1g，按2.2.1中（1）中的计算方式进行处理。每个样品，使用电子天平称量的次数为4次，计算得到：

相对不确定度ure1l-2= u2/m×100=0.440%。

（3）分析天平重复性引入的测量不确定度urel1-3

校准证书给出天平偏载允许误差限为0.15g，按2.2.1中（1）中的计算方式进行处理。每个样品，使用电子天平称量的次数为4次，计算得到：

相对不确定度urel1-3=u3/m×100=1.360%。

（4）分析天平的合成标准不确定度

2.2.1.2 使用的容量瓶引入的测量不确定度urel2

按照JJG196《常用玻璃量器检定规程》中的要求，容量为50mL的A级单标线容量瓶的最大示值允许误差为0.05mL，每个样品，共使用两次。按2.2.1中（1）进行处理：

2.2.1.3 使用的移液管引入的测量不确定度urel3

按照JJG196《常用玻璃量器检定规程》中的要求及处理过程1.3产生的不确定度分量见表1：

表1 样品处理过程移液管产生的不确定度

综上可知，分析天平、容量瓶及移液管3个不确定度分量是相互独立的，因而样品前处理的合成标准不确定度用公式（3）进行计算：

2.2.2 标准曲线配制的不确定度u′rel

根据1.4标准溶液配制所产生的不确定度。

（1）标准使用液的测量不确定度u′rel1

标准使用液使用容量瓶引入的测量不确定度u′rel1-1

单个50mL容量瓶的测量不确定度见2.2.1.2评定的结果，urel2=0.057%。由于配制标准曲线使用的5个容量瓶是相互独立的，所以其合成不确定度：

标准使用液使用的移液管引入的测量不确定度u′rel1-2

按照JJG196《常用玻璃量器检定规程》中的要求及标准曲线配制所产生的不确定度分量见表2：

标准使用液的测量合成标准不确定度：

表2 标准曲线配制中移液管所产生的不确定度

（2）标准物质的测量不确定度u′rel2

检测中使用了国家质量监督检验检疫总局发布的食品甜味剂环己基氨基磺酸钠溶液标准物质，证书号GBW(E)100173，含量为10.00mg/mL，相对扩展不确定度为Ur=1%（k=2）。则标准物质的测量不确定度：

（3）配制1.00mg/mL储备液的测量不确定度u′rel3

标准物质溶液被稀释成1.00mg/L储备液，用于制作标准曲线，引入了1mLA级单标线移液管不确定度和10mLA级容量瓶不确定度。根据JJG196《常用玻璃量器检定规程》中的要求得：

1mLA级单标线移液管的不确定度：

10mLA级容量瓶得不确定度：

配制1.00mg/mL储备液的测量的合成标准不确定度：

（4）标准直线的测量不确定度u′rel4

3 结论

通过分析影响测量不确定度的各分量发现，影响液相色谱法检测果汁饮料中甜蜜素的不确定度主要是样品处理及校准。因此，在测量样品过程中要严格控制实验条件，严格按照规定操作，并且高度重视校准线型及校准的控制，确保检验结果的可靠[2]。