新诊断胶质瘤MGMT基因启动子甲基化水平定量分析

张国臣 常玉喜 韩 磊 徐 欣 赵 明 陈忠平

O6-甲基鸟嘌呤-DNA 甲基转移酶（O6-methylguanine-DNA methyltransferase，MGMT）可以修复烷化剂对染色体的致癌、致突变和细胞毒作用的损伤。在正常情况下，MGMT对细胞起保护作用，但是在胶质瘤的化疗过程中，MGMT 可以修复化疗药物对胶质瘤细胞产生的杀伤，从而降低化疗疗效[1]。MGMT 基因启动子甲基化（简称MGMT 甲基化）可以降低MGMT的表达。本文定量分析新诊断胶质瘤MGMT甲基化水平，为临床诊治提供参考。

1 资料和方法

1.1 标本来源 收集郑州大学附属肿瘤医院神经外科2016年1月至2019年6月手术切除并经病理诊断为胶质瘤标本225例，其中男116例，女109例；平均年龄（48.71±14.82）岁；少突胶质细胞瘤50 例（WHO分级Ⅱ级36 例，Ⅲ级14 例），星形细胞瘤109 例（WHO分级Ⅰ级4例，Ⅱ级58例，Ⅲ级47例），少突星形细胞瘤9 例（WHO 分级Ⅱ级），胶质母细胞瘤（WHO分级Ⅳ级）57例。

1.2 入组标准 经手术病理证实为胶质瘤；新诊断初治胶质瘤；肿瘤组织行MGMT甲基化水平检测。

1.3 排除标准 术后病理证实为非胶质瘤；既往经过放、化疗等治疗的复发胶质瘤；肿瘤组织未行MGMT甲基化水平检测。

1.4 MGMT 的检测 采用焦磷酸测序仪（美国QIAGEN 公司，Qiagen PyroMark Q24），严格按照Human MGMT Gene methylation Detection Kit 试剂盒（美国QIAGEN公司）说明书进行测序。采用TIANamp FFPE DNA Kit 提取DNA，DNA 浓度为20 ng/μl，OD 260/280 为1.82，检测灵敏度为1%（10 ng/μl DNA），引物类型为YGAYGTTYGTAGGTTTTYGT。标本类型为石蜡块。结果判读：选择MGMT 基因启动子区甲基化水平最高的4 个CpG 位点，将各位点的甲基化水平以百分率的形式作为定量数据，取4 个位点的平均值作为最终MGMT甲基化水平。

1.5 判断标准 健康人群血液平均检测值：MGMT 甲基化水平≤4%。胶质瘤平均检测值：MGMT 甲基化水平≥8%为阳性，否则判为阴性，其中MGMT甲基化水平≥40%病人，替莫唑胺化疗总生存期明显延长[2]。1.6 统计学方法 利用SPSS 19.0软件处理，计量资料以±s表示，采用t检验和单因素方差分析；计数资料采用χ2检验；采用Pearson 相关系数或Spearman秩相关系数分析相关性；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

新诊断胶质瘤MGMT基因启动子甲基化水平为（23.68±14.88）%，阳性率为89.33%。≥40 岁病人MGMT 甲基化水平明显高于＜40 岁病人（P＜0.05，表1），少突胶质细胞瘤MGMT 甲基化水平较星形细胞瘤、少突星形细胞瘤、胶质母细胞瘤均明显增高（P＜0.05，表1）。而不同性别、不同WHO 分级病人MGMT甲基化水平均无明显差异（P＞0.05，表1）。胶质瘤MGMT 甲基化水平与病人年龄呈正相关（r=0.135，P＜0.05），而与病人性别和肿瘤WHO 级别无明显关系（P＞0.05）。

3 讨论

MGMT既能修复外界不良因素对正常细胞造成的损害，也可修复化疗药物对肿瘤细胞造成的杀伤。影响MGMT 表达的因素很多。Ovchinnikov 等[3]证实，MGMT基因启动子CpG岛处于甲基化状态，可导致MGMT 基因停止转录，从而减少MGMT 的表达。另外，赵宇航等[4]发现胶质瘤细胞MGMT 甲基化、IDH1 突变、P53 和TERT 突变之间存在复杂的相互调节作用。目前认为，MGMT 甲基化是胶质瘤病人预后良好的独立预测因素之一[5]，检测胶质瘤细胞MGMT甲基化可以预测烷化剂等化疗药物的效果[6]。

对于MGMT 甲基化检测方法，起初多采用免疫组织化学法，并将其分为阴性（-）、弱阳性或可疑阳性（+/-）、阳性（+）、中等阳性（++）、强阳性（+++），间接说明MGMT甲基化程度[7]，并用于指导胶质瘤化疗方案的选择[8]；但是该方法为MGMT 的定性分析，结果受主观因素影响较大，且表达量的多少容易受到电离辐射、糖皮质激素等的影响，并不能精确地指导化疗。随着分子生物学技术的发展，Pulling等[9]利用甲基化特异性聚合酶链反应检测MGMT 甲基化水平，并与既往免疫组织化学法结果相比较，两者符合率达83%，但没有研究MGMT 甲基化的程度。对于MGMT甲基化阳性病例，因MGMT活性有强弱之分，对化疗药物的杀伤修复能力也一定有差别，化疗药物效果也势必不同，因此，单纯定性分析MGMT甲基化，并不能很好地指导化疗。

表1 新诊断胶质瘤MGMT基因启动子甲基化水平量化分析结果

我们采用焦磷酸测序检测方法，选择MGMT 基因启动子甲基化水平最高的四个CpG 位点，将甲基化水平以百分率的形式表示，取四个位点的平均值进行量化分析MGMT 甲基化水平。按照本文标准，本文病人MGMT 甲基化阳性率为89.33%，且不受性别、年龄、肿瘤类型、肿瘤级别的影响，与文献[10]报道基本相符。虽然MGMT 甲基化阳性率较高，但是胶质瘤病人预后并不好，本文发现MGMT 甲基化水平≥40%的病人仅占11.11%，可能调高MGMT 甲基化阳性标准更符合临床实际。黄磊等[11]报道，MGMT水平与年龄呈负相关，且男性MGMT mRNA 含量较女性高。本文MGMT 甲基化水平与病人年龄正相关，年龄越大MGMT甲基化水平越高（P＜0.05），但是不同性别之间并无明显差异（P＞0.05），与上述文献不全相符。另外，我们还发现，不同病理类型胶质瘤MGMT 甲基化水平也有差异，少突胶质细胞瘤MGMT 甲基化水平明显高于星形细胞瘤（P＜0.05），与文献[12]报道相符，这可能也是少突胶质细胞瘤病人放、化疗效果较好的原因之一。唐天友等[13]认为，MGMT 甲基化水平越高，胶质瘤级别越高。陈功等[14]认为高级别胶质瘤MGMT甲基化水平低于低级别胶质瘤，并认为其是高级别胶质瘤预后较差的因素之一。本文结果显示，MGMT 甲基化水平与胶质瘤级别均无明显关系（P＞0.05），与文献报道不同，实际情况有待进一步研究验证。总之，新诊断胶质瘤MGMT 甲基化水平与病人与年龄正相关，少突胶质细胞瘤MGMT 甲基化水平明显高于其他类型胶质瘤。