角质细胞N-甲基-D-天冬氨酸受体在Ⅰ型复杂区域疼痛综合征中的作用

刘 庆，徐宵寒，许 力，黄宇光

1中国医学科学院 北京协和医学院 整形外科医院麻醉科，北京 100144 2中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院麻醉科，北京 100730

复杂性区域疼痛综合征(complex regional pain syndrome，CRPS)是一种慢性疼痛综合征，发生在如扭伤、骨折、组织损伤和局部缺血等损伤后，并呈现出一系列不同程度的疼痛、血管和自主神经变化，常导致重要功能损伤和残疾[1]。传统上，CRPS分为Ⅰ型和Ⅱ型，前者没有明确的神经损伤，而后者存在可验证的神经病变。CRPS患者通常始于急性发作阶段，表现为受影响的肢体疼痛、发热、水肿，再到发热和水肿消退的慢性阶段，但疼痛依然存在。N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartic acid receptor，NMDA)受体属于谷氨酸门控离子通道中的一种，主要参与突触形成、记忆、痛觉过敏等功能[2]，但其在外周组织中的作用尚不清楚。有研究证实，坐骨神经损伤模型中消除NMDA受体可以完全阻断持续的疼痛样行为以及NMDA受体介导的神经元死亡可导致慢性神经性疼痛的发生[3]。另有研究指出，NMDA受体存在于中枢神经系统的非神经细胞及非神经外周组织中，例如皮肤、肺、肾、胰腺等，并有着截然不同的生理功能。由于CRPS患者皮肤的局部症状特别明显，此外在骨折制动的CRPS模型中发现，患肢皮肤中促炎因子明显增加，同时皮温升高、肢体水肿、后肢痛觉过敏[4]。考虑到角质细胞是皮肤的主要细胞以及激活的角质细胞与传入感觉神经末梢相互作用，参与疼痛传导[5]。本研究观察了大鼠慢性缺血后疼痛(chronic post ischemia pain，CPIP)模型术后皮肤中NMDA受体表达的细胞来源，探讨了NMDA受体在 Ⅰ 型CRPS中的作用。

材料和方法

材料戊巴比妥钠(国药集团化学试剂有限公司)，内径0.56丁腈橡胶O形环(ASL康大化工公司)，NMDA、MK801(美国Sigma-Aldrich公司)，异氟烷(北京协和医院麻醉科)，电子von Frey(美国IITC公司)，小鼠抗pan-keratin、兔抗NR1(NMDA受体1)、兔抗肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α、兔抗白细胞介素(interleukin，IL)-1β抗体(美国Abcam公司)，Alex-488标记山羊抗小鼠IgG、Alex-596标记山羊抗兔IgG、马血清(中杉金桥公司)，辣根过氧化物标记羊抗兔IgG(法国Ab Science公司)，增强化学发光法(enhanced chemiluminescence，ECL)超敏发光液(康维世纪公司)，SDS-PAGE凝胶、PVDF膜(CRPS Bio-Rad公司)。

实验动物及分组SPF级雄性大鼠42只，体质量(220±15)g，购自中国食品药品检定研究院(合格证号：SCXK京2014-0013)，饲养于北京协和医学院基础学院实验动物中心，饲养房间行12 h/12 h的昼/夜光照节律，室温维持在25℃，房间湿度50%。待大鼠适应性喂养至少1周后开始进行实验。本实验动物操作经过北京协和医院实验动物伦理委员会批准。

采用随机数字表法将大鼠随机分为假手术(Sham)组(n=12)、CPIP组(n=12)、CPIP+生理盐水(normal saline，NS)组(n=6)、CPIP+NMDA组(n=6)、CPIP+NMDA受体抑制剂(MK801)组(n=6)5组。CPIP组造模过程如下：经腹腔注射40 mg/kg 2%戊巴比妥钠溶液麻醉后，将O型环套入大鼠右后肢踝关节处造成右后肢缺血，必要时追加首剂戊巴比妥钠的1/4，以维持大鼠3 h的全身麻醉状态；3 h后将O型环剪断，让肢体再灌注。Sham组则麻醉后将剪断的O型环系于相同踝关节处，3 h后取下。Sham组和CPIP组均随机选取6只用于造模24 h后取材，深麻醉下处死大鼠并取皮肤，右足底皮肤组织一分为二，分别保存于甲醛和液氮；其余大鼠继续实验。CPIP+NS组、CPIP+NMDA组和CPIP+MK801组大鼠自造模后第7日至13日，将其放入含有少量异氟烷的玻璃密封罐中，麻醉后大鼠取俯卧位，分别以1 ml一次性注射器抽取100 μl 浓度为1 mmol/L 的NS、NMDA溶液和MK801溶液，于大鼠右后肢足底第2、3趾间，与皮肤表面成10～20°夹角的方向进针，回抽确认无回血，皮下注射后缓慢退针。造模后2、6、10、14 d行机械痛阈测试，并在建模后14 d取材，取大鼠右足底皮肤和L3～L5脊髓保存于液氮。

免疫荧光检测取材后将皮肤组织放入4%多聚甲醛固定16～32 h后置于20%蔗糖溶液过夜脱水，将组织放入模具中加入OCT包埋，切片6 μm并贴片，0.3% Triton溶液破膜后将玻片用PBS溶液漂洗3次，每次5 min，用1%BSA溶液稀释10×马血清封闭1 h，后加1%BSA稀释鼠抗pan-keratin(1∶50)、兔抗NR1(1∶500)混合滴加于组织上并4℃冰箱过夜。漂洗同前，滴加1%BSA稀释的Alexa-596标记山羊抗小鼠IgG(1∶100)和Alexa-488标记山羊抗兔IgG(1∶100)避光室温孵育1 h，漂洗同前，用含DAPI的抗淬灭封闭液将玻片封闭处理，盖上盖玻片并于荧光显微镜下观察、拍照。

Western blot检测采用60 mg/kg戊巴比妥钠腹腔注射大鼠深麻醉下，取右足底皮肤和L3～L5脊髓放置于液氮上冷却的冻存管中，于-80℃冰箱保存。称取皮肤组织和脊髓组织按重量和蛋白裂解液1∶10在玻璃匀浆器中研磨提取总蛋白并测定蛋白浓度，每次电泳每个泳道保证蛋白上样量为30 μg，采用10%分离胶电泳分离蛋白，然后再转膜至PVDF膜，用5%脱脂牛奶封闭1 h后，将相应分子量条带剪下并和抗NR1(1∶1000)、抗IL-1β(1∶1000)、抗TNF-α(1∶1000)、抗β-actin(1∶2000)在4℃摇床上过夜。TBST洗膜3次，每次10 min，然后将条带与用辣根过氧化物标记羊抗兔IgG(1∶3000)室温孵育1 h，洗膜同前，避光将条带滴加ECL发光液并用天能化学发光成像系统成像，保存图像用于后续Image J分析。Image J分析得到蛋白显影的光密度值，将每组的蛋白光密度值均除以Sham组的蛋白光密度值，令Sham组蛋白光密度值为1设为对照，再进行相应统计学分析。

行为学测试将待测大鼠在玻璃箱内适应30 min后，采用电子Von-Frey金属丝分别垂直刺激大鼠右后足底，缓慢加压刺激右后足底皮肤，大鼠如在刺激过程中产生明显缩爪或舔足，即为阳性反应，记录仪器数值。同一强度反复测定3次，连续2次之间至少间隔10 s，将3次读数取平均值作为机械刺激缩足阈值(mechanical withdrawal threshold，MWT)。

统计学处理采用Graphpad Prism7.0统计软件[6]，符合正态分布的计量资料以均数±标准差表示，两组间比较采用非配对双尾t检验[7-8]；多组间比较首先采用单因素方差分析，若各组水平均数之间差异有统计学意义时，由于各组样本例数相等，事后检验所有组之间两两比较采用Tukey检验；MTW值采用重复测量双因素方差分析，组间比较采用Tukey多重比较法[9]；P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

CPIP造模后皮肤组织中NR1的表达造模1 d后，取大鼠术侧足底皮肤进行冰冻切片和免疫荧光染色，分别用NR1标记NMDA受体亚基，用pan-keratin标记皮肤角质细胞。结果显示，Sham组皮肤中存在少量绿色荧光(NR1)，NR1与红色荧光皮肤角质细胞标记物pan-keratin存在共定位关系，并且在CPIP造模后NR1的表达增加。造模第14天后，NR1受体仍持续在皮肤组织中激活，标记NR1的红色荧光明显增强(图1)。

Westernblot检测结果显示，造模1 d和14 d后，CPIP组NR1蛋白的光密度值分别为1.747±0.061(t=12.120，P<0.001)和1.708±0.064(t=10.910，P<0.001)，均明显高于Sham组的1.000±0.000(图2)。

NR1：N-甲基-D-天冬氨酸受体1；CPIP：慢性缺血后疼痛
NR1：N-methyl-D-aspartic acid receptor 1；CPIP：chronic post-ischemia pain
图1大鼠术侧足底皮肤NR1与角蛋白免疫荧光检测结果
Fig1Immunofluorescence results of NR1 and keratin in plantar skin

Mr：相对分子质量；与Sham组比较，at=12.120，P<0.001；bt=10.910，P<0.001
Mr：relative molecular mass；at=12.120，P<0.001；bt=10.910，P<0.001 compared with Sham group
A.Western blotting检测结果；B.NR1相对表达量比较(n=6)
A.Western blotting of NR1；B.quantitative analysis of NR1(n=6)
图2大鼠术侧足底皮肤NR1的表达
Fig2Protein expression of NR-1 in plantar skin

CPIP造模后皮肤组织和脊髓组织中炎症因子的表达造模1 d后，CPIP组皮肤组织的IL-1β和TNF-α表达量分别为2.575±0.305(t=5.158，P=0.003)和2.691±0.217(t=7.786，P<0.001)，均明显高于假手术组的1.000±0.000；脊髓中的IL-1β和TNF-α的表达量分别为1.467±0.222(t=2.099，P=0.062)和1.132±0.105(t=1.253，P=0.238)，与Sham组的1.000±0.000差异无统计学意义(图3)。

NMDA受体对慢性缺血大鼠机械痛阈的影响造模后第2天，CPIP+NS组、CPIP+NMDA组和CPIP+MK801组的MTW值分别为(21.34±0.84)g(q=7.329，P<0.001)、(21.16±1.32)g(q=7.752，P<0.001)和(21.06±0.99)g(q=8.002，P<0.001)，均明显低于Sham组的(24.37±0.82)g。造模后第6天，CPIP+NS组、CPIP+NMDA组和CPIP+MK801组的MTW值分别为(20.38±0.77)g(q=11.130，P<0.001)、(20.69±1.26)g(q=10.380，P<0.001)和(21.13±0.69)g(q=9.323，P<0.001)，也均明显低于Sham组的(24.98±1.22)g，CPIP+NS、CPIP+NMDA和CPIP+MK801 3组间差异无统计学意义(P均>0.05)。造模后第10天，CPIP组+NS组和CPIP+NMDA组的MTW值分别为(20.37±0.95)g(q=8.844，P<0.001)和(15.85±1.09)g(q=19.770，P<0.001)，明显低于Sham组的(24.02±0.35)g；CPIP+MK801组MTW值为(22.95±0.96)g，与Sham组差异无统计学意义(q=2.603，P=0.262)；与CPIP+NS组相比，CPIP+MK801组显著升高(q=6.241，P<0.001)，CPIP+NMDA组显著降低(q=10.920，P<0.001)。造模后第14天，CPIP组+NS组和CPIP+NMDA组的MTW值分别为(21.57±0.96)g(q=7.542，P<0.001)和(16.53±1.63)g(q=19.730，P<0.001)，明显低于Sham组的(24.69±0.40)g；CPIP+MK801组的MTW值为(23.27±1.28)g，与Sham组差异无统计学意义(q=3.449，P=0.780)；与CPIP+NS组相比，CPIP+NMDA组显著降低(q=12.190，P<0.001)，CPIP+MK801组显著升高(q=3.449，P=0.024)。

IL-1β：白细胞介素-1β；TNF-α：肿瘤坏死因子-α；Mr：相对分子质量；与Sham组比较，at=5.158，P=0.003；bt=7.786，P<0.001；ct=2.099，P=0.062；dt=1.253，P=0.238
IL-1β：interleukin-1β；TNF-α：tumor necrosis factor-α；Mr：relative molecular mass；at=5.158，P=0.003；bt=7.786，P<0.001；ct=2.099，P=0.062；dt=1.253，P=0.238 compared with Sham group
A.皮肤IL-1β和TNF-α蛋白表达情况；B.皮肤IL-1β和TNF-α蛋白相对表达量比较(n=6)；C.L3～L5脊髓IL-1β和TNF-α蛋白表达情况；D.L3～L5脊髓IL-1β和TNF-α蛋白相对表达量比较(n=6)
A.Western blotting of IL-1β and TNF-α in skin tissue；B.quantitative analysis of IL-1β and TNF-α in skin tissue(n=6)；C.Western blotting of IL-1β and TNF-α in L3-L5 spine tissue；D.quantitative analysis of IL-1β and TNF-α in L3-L5 spine tissue(n=6)
图3急性期大鼠术侧足底皮肤和L3～L5脊髓中炎症因子的表达
Fig3Protein expression of IL-1β，TNF-α in plantar skin and L3-L5 spine tissue of acute phase

NMDA受体对CPIP大鼠皮肤和脊髓中炎症因子的影响造模后第14天，Sham组、CPIP+NS组、CPIP+NMDA组和CPIP+MK801组皮肤组织中IL-1β表达量分别为1.000±0.000、1.013±0.080、1.120±0.100和1.063±0.090，各组间差异无统计学意义(F=2.917，P=0.059)；Sham组、CPIP+NS组、CPIP+NMDA组和CPIP+MK801组皮肤组织中TNF-α表达量分别为1.000±0.000、1.064±0.065、1.043±0.156和1.013±0.045，各组间差异也无统计学意义(F=0.657，P=0.587)。Sham组、CPIP+NS组、CPIP+NMDA组和CPIP+MK801组脊髓中IL-1β的表达量分别为1.000±0.000、2.518±0.147、4.816±0.607和1.048±0.257，CPIP+NS组(q=11.010，P<0.001)和CPIP+NMDA组(q=27.680，P<0.001)较Sham组显著升高，CPIP+MK801组与Sham组差异无统计学意义(q=0.348，P=0.994)；与CPIP+NS组相比，CPIP+NMDA组显著升高(q=16.670，P=0.003)，CPIP+MK801组显著降低(q=10.660，P<0.001)。Sham组、CPIP+NS组、CPIP+NMDA组和CPIP+MK801组脊髓中TNF-α表达量分别为1.000±0.000、1.949±0.184、2.629±0.349和0.79±0.165，CPIP+NS组(q=10.870，P<0.001)和CPIP+NMDA组(q=18.660，P<0.001)较Sham组显著升高，CPIP+MK801组与Sham组差异无统计学意义(q=2.406，P= 0.349)；与CPIP+NS组相比，CPIP+NMDA组显著升高(q=7.790，P<0.001)，CPIP+MK801组显著降低(q=13.280，P<0.001)(图4)。

讨 论

NMDA受体属于谷氨酸门控离子通道中的一种，根据谷氨酸受体对合成激动剂的药物反应性，另外还有α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸和红藻氨酸受体[10]。自1991年报道其最初克隆结果以来[11]，已知NMDA受体在突触传递和可塑性中起着核心作用，并且在过去30年中一直是积极研究的主题。NMDA受体作为跨膜异聚体离子通道，对Ca2+有极强通透性，每个NMDA受体亚型都是由2个GluN1和2个Glu2(A-D)或GluN3(A-B)亚单位组成的四异聚体[12]。亚单位不同组合的多种受体类型表达允许单一激动剂谷氨酸盐在不同位置和不同环境下激活不同的信号传导机制，表现出不同的特性和功能性区域[13]。NR1(GluN1)是NMDA受体组装、跟踪其他亚基功能活动的必要组成部分。尽管NMDA受体主要表达在中枢神经系统组织中，但其也存在于非神经外周组织中。Genever等[14]研究表明，新生大鼠和成年大鼠皮肤基底层角质形成细胞表面显示出NMDA型谷氨酸受体亚型NMDAR1的特异性和强细胞周免疫活性，沿表皮染色强度无明显变化，而基底角质细胞虽然也使NMDA2A/B亚单位共定位，但染色水平明显较低。本研究也证实，NR1与皮肤角质细胞标记物pan-keratin存在共定位表达，且NR1在大鼠CPIP造模后术侧足底皮肤中表达明显升高，提示角质细胞中NMDA受体在大鼠CPIP模型中可能起到促进作用。

细胞因子是由淋巴细胞和巨噬细胞以及各种其他类型细胞产生的一组不同种类的可溶性小多肽，是组织损伤相关炎症和疼痛的细胞信号传导关键参与者[15]。研究显示，CRPS患者皮肤水疱液中的IL-6、TNF-α和内皮素等水平明显升高[16]；对CRPS患者的血清研究也发现，CRPS患者的IL-6和TNFα水平较对照组显著升高，IL-10水平较对照组显著降低[17]。虽然皮肤炎症介质因子在CRPS肢体中表达上调，但在这些患者中没有经典免疫系统激活的证据。由于角质细胞是表皮的主要组成细胞类型，角质细胞亦是引发和维持炎症的关键细胞。皮肤角质细胞中炎性介质因子或其受体的失调和异常表达与几种慢性炎性皮肤病如银屑病、特应性皮炎和变应性接触性皮炎的病因有关[18-19]。基于以上文献，我们怀疑皮肤中的常驻细胞可能是CRPS患者皮肤中炎症介质的主要来源。利用大鼠CPIP模型，我们证实缺血肢体后爪皮肤中IL-1β和TNF-α表达水平升高，另也有文献证明在大鼠骨折模型中这些炎症因子可使伤害感受性敏化[20]。

与假手术组比较，aq=11.010，P<0.001；bq=27.680，P<0.001；cq=10.870，P<0.001；dq=18.660，P<0.001；与CPIP+NS比较，eq=16.670，P=0.003；fq=10.660，P<0.001；gq=7.790，P<0.001；hq= 13.280，P<0.001
aq=11.010，P<0.001；bq=27.680，P<0.001；cq=10.870，P<0.001；dq=18.660，P<0.001 compared with Sham group；eq=16.670，P=0.003；fq=10.660，P<0.001；gq=7.790，P<0.001；hq= 13.280，P<0.001 compared with CPIP+NS group
A.皮肤IL-1β和TNF-α蛋白表达情况；B.皮肤IL-1β和TNF-α蛋白相对表达量比较(n=6)；C.脊髓IL-1β和TNF-α蛋白表达情况；D.脊髓IL-1β和TNF-α蛋白相对表达量比较(n=6)
A.Western blotting of IL-1β and TNF-α in skin tissue；B.quantitative analysis of IL-1β and TNF-α in skin tissue(n=6)；C.Western blotting of IL-1β and TNF-α in spine tissue；D.quantitative analysis of IL-1β and TNF-α in spine tissue(n=6)
图4慢性期大鼠术侧足底皮肤和L3～L5脊髓中炎症因子的表达
Fig4Protein expressions of IL-1β and TNF-α in plantar skin and L3-L5 spine tissue of chronic phase

在大鼠后肢慢性缺血后，角质细胞中NR1受体被激活以及表达高水平的炎症因子，共同介导炎性反应和疼痛过敏。在造模后第2天和第6天，CPIP各组的MTW值都明显降低。但是在分别给予皮下注射NR1和MK801后，与CPIP+NS组相比，CPIP+NMDA组机械痛阈明显降低，而CPIP+MK801组机械痛阈明显升高。提示外周干预NMDA受体可对大鼠CPIP产生影响。NMDA受体参与疼痛的机制已有很多研究。在坐骨神经损伤的小鼠模型中，功能性多巴胺受体缺乏的小鼠在神经损伤后表现出正常的伤害感受性反应和急性疼痛，但这种疼痛敏感性的最初增加是可逆的，而消除NMDA受体可以完全防止持续的类似疼痛行为，NMDA受体介导的神经元死亡导致了慢性神经病理性疼痛的发展[3]。慢性疼痛超敏反应取决于NMDA受体。然而，由于抑制NMDA受体会产生生理功能不良反应，NMDA受体阻断剂的临床应用受到抑制。有研究报道了一种在不阻断NMDA受体情况下抑制痛觉过敏的方法，是通过抑制NMDA受体功能关键增强子蛋白酪氨酸激酶Src的结合，可预防由足底福尔马林诱导的疼痛行为，以及足底注射完全弗氏佐剂或由周围神经损伤引起的逆转的皮肤超敏反应[21]。本研究则是选择了利用NMDA受体和该受体拮抗剂MK801在大鼠术侧后肢皮下注射给药，避免了全身给药或是鞘内注射NMDA受体导致其受抑制带来的不良反应。在大鼠CPIP模型早期，我们发现皮肤炎症因子表达上升，但在造模14 d后皮肤炎症因子与Sham组相比无明显差异，但是注射NMDA受体的大鼠脊髓炎症因子表达显著高于CPIP+NS组，同时该组的机械痛阈阈值也显著低于CPIP+NS组；而CPIP+MK801组的结果则与之相反。因此更加证实了NMDA受体在大鼠CPIP模型中可促进炎性反应和外周痛觉过敏，并且通过调控外周NMDA受体激活和抑制，影响远期的中枢敏化和脊髓炎症因子表达，并最终改善大鼠的痛觉过敏现象。提示皮肤角质细胞NMDA受体激活可能是外周组织产生炎症因子和介导疼痛的可能机制。

本研究对L3～L5节段脊髓的Western blot检测结果发现，CPIP急性期未见炎症因子变化；慢性期可见促炎因子IL-1β和TNF-α表达水平升高，在NMDA受体拮抗剂的作用下，上述慢性期变化可被抑制。以上CRPS慢性期脊髓变化与骨折-包扎制动模型中大致相符，即骨折制动4周后CRPS大鼠脑脊液中促炎性细胞因子IL-1、IL-6、TNF和CCL2水平升高，选择性TNF和IL-1受体拮抗剂鞘内注射可以缓解痛觉过敏[7，22]。另有临床研究证实，CRPS患者脑脊液中促炎性炎症因子和星形胶质细胞标志物胶质纤维酸性蛋白水平升高，尸检的组织病理学证实小胶质细胞和星形胶质细胞激活[23-24]。但也有文献报道CRPS中枢敏化以星形胶质细胞(而非小胶质细胞)激活[25]为主，因此本研究还需后续更为严谨的实验提供确切结论。

考虑到胶质细胞[25]是脊髓炎症因子的主要来源，我们推测：CRPS慢性期角质细胞NMDA受体持续激活，疼痛刺激自外周传入脊髓背角，引起星形角质细胞和小胶质细胞激活，释放促炎性细胞因子，并导致中枢敏化；而在急性期，虽然已有疼痛刺激传入脊髓，但其尚未引起胶质细胞激活和炎症因子释放。上述CRPS慢性期中枢神经系统改变的病生理机制目前尚未明确，但可能与P物质、降钙素基因相关肽神经肽信号传导[26-27]，细胞外信号调节激酶1/2、基质金属蛋白酶2[8]、c-jun N末端激酶1/2磷酸化[8]，以及脊髓NMDA受体 NR2B亚基的磷酸化和钙离子/钙调蛋白依赖蛋白酶2上调细胞内钙离子浓度等[28]有关。本研究后续仍将对疼痛刺激传入中枢的机制和下游信号通路方面进行深入研究。

综上，本研究发现，大鼠慢性缺血后可激活皮肤NMDA受体并引起皮肤角质细胞的活化，导致皮肤伤害性炎症介质和慢性期脊髓中炎症因子的表达，这可能引起CRPS。