姜黄素对高浓度葡萄糖诱导的RF/6A 细胞血管生成的抑制作用

李建波，张静，罗永锋，李小珩

糖尿病性视网膜病变（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病最常见的眼部并发症，也是成年人致盲的主要原因之一[1]。高血糖等因素导致视网膜微血管病变，致使疾病晚期出现视网膜新生血管，继发视网膜脱离和玻璃体积血等是患者视力丧失的主要因素[2]。DR 的发生机制与多种因素有关，由于复杂的细胞间相互作用，所有视网膜细胞均出现了生化和代谢异常。过去20 年的大量研究表明，氧化应激、炎症、血管生成相关因子是引发糖尿病视网膜并发症发生的关键机制[3]。姜黄素是从传统中药姜科姜黄属植物的根茎中提取的一种黄色多酚，近年来研究[4]发现，姜黄素不仅具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等药理活性，还具有抗动脉粥样硬化、调节血脂、抗心律失常等心血管保护作用。不过，姜黄素能否在治疗DR，尤其是其视网膜新生血管中发挥作用还不清楚。鉴于此，本研究拟在体外观察姜黄素对高浓度葡萄糖培养的恒河猴脉络膜-视网膜内皮细胞 （rhesus choroido-retinal endothelial cell,RF/6A） 血管生成的影响，为进一步明确姜黄素在治疗DR 中的作用奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

RF/6A 细胞（中科院上海细胞库），DMEM 培养基及D-葡萄糖（美国Gibco 公司），胎牛血清（美国Invitrogen 公司），姜黄素（美国Sigma 公司），CCK-8细胞增殖检测试剂盒 （碧云天生物公司），Transwell及Matrigel（美国BD 公司）。

1.2 细胞处理及分组

将RF/6A 细胞置于含有10%胎牛血清的DMEM 培养基中，在37℃、5%CO2条件下常规培养。消化后用相应培养基制备单细胞悬液，按照每孔1×104个将细胞接种于96 孔板，细胞贴壁后按照如下分组进行处理：对照组（含10%胎牛血清的DMEM培养基），高糖组（DMEM 培养基中加入25 mmol/LD-葡萄糖），高糖+姜黄素组（DMEM 培养基中加入25 mmol/L D-葡萄糖＋30 μmol/L 姜黄素），在37℃、5%CO2及饱和湿度条件下培养3 d。

1.3 CCK-8 法检测RF/6A 细胞增殖活力

0.25 %胰蛋白酶消化处于对数生长期的复苏后第3 代细胞，用培养基制成细胞悬液（5×104个细胞/mL），在96 孔板中接种细胞悬液（100 μL/孔），将培养板放在37℃、5%CO2培养箱中培养。按照上述不同分组处理3d，向每孔加入标准制式的CCK-8 溶液10μL，将培养板在培养箱内孵育4 h，用酶标仪测定每孔在450 nm 处的吸光度（A），计算细胞增殖活力。细胞增殖活力（%）=[A（加药）-A（空白）]/[A（0 加药）-A（空白）]×100%。A（加药）：具有细胞、CCK-8 溶液和药物溶液的孔的吸光度；A （空白）： 具有培养基和CCK8 溶液而没有细胞的孔的吸光度；A（0 加药）：具有细胞、CCK8 溶液而没有药物溶液的孔的吸光度。

图1 观察各组RF/6A 细胞形态学变化（×100）。1A 对照组；1B 高糖组；1C 高糖+姜黄素组

1.4 Transwell 法检测RF/6A 细胞迁移

取对数生长期的细胞，0.25%胰蛋白酶消化后用DMEM 培养基制成单细胞悬液，计数后按照每孔5×105个细胞均匀接种至6 孔板中，37℃、5%CO2培养箱种过夜培养。按照上述分组条件处理3 d，消化细胞，离心弃去培养液，PBS 液洗2 遍，用无血清培养基重悬细胞，调整细胞密度至2×105个/mL。在24孔板中加入800 μL 含10%胎牛血清的DMEM 培养基，并放入Transwell 小室，取各组细胞悬液200 μL加入Transwell 上室，常规培养24 h。取出Transwell小室，弃去孔中培养液，PBS 洗2 遍，用70%冰乙醇溶液固定1 h，将小室适当风干。0.5%结晶紫染液染色20 min，用棉签轻轻擦掉上层未迁移的细胞，PBS洗3 遍，显微镜下观察计数5 个低倍视野（×200）的穿膜细胞数，取平均值。

1.5 Matrigel 法检测RF/6A 细胞血管形成

将Matrigel 放于冰盒中，在4℃冰箱内过夜使胶缓慢融化，同时4℃预冷枪头和24 孔板。用预冷枪头迅速将胶以每孔200 μL 加至预冷的24 孔板中，轻摇培养板使其评铺板底，置入37℃培养箱中孵育30 min 使胶凝固。取上述不同分组处理3 d 的细胞，制备单细胞悬液，计数后按照每孔2×105/个接种到铺好胶的24 孔板中，37℃、5%CO2培养箱中过夜培养，显微镜下随即取3 个低倍视野（×100）拍照。采用Image J 图像分析软件计算血管分支点数和分支长度（每3 个分叉处记作一个血管腔），取平均值。

1.6 统计学方法

采用SPSS 17.0 统计软件进行分析，计量资料以均数±标准差（）表示，多组间比较采用方差分析，组间两两比较采用LSD-t 检验，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RF/6A 形态学变化

在显微镜下观察培养3 d 时的RF/6A 细胞形态，发现细胞多呈椭圆形或短梭形，排列致密，各组细胞均有不同程度的凋亡（胞体萎缩变小，形态不规则），高糖组细胞凋亡较对照组明显增多，姜黄素处理后有所改善，凋亡细胞较高糖组明显减少（图1）。

2.2 姜黄素对RF/6A 细胞增殖活力的影响

CCK-8 检测显示，不同处理组RF/6A 细胞的增殖活力分别为： 对照组（99.55±0.57）%，高糖组（72.53±2.20）%，高糖＋姜黄素组（92.75±2.37）%，3 组间总体比较差异具有统计学意义（F=329.10，P=0.000）。与对照组相比，高糖组（t=29.07，P=0.000）和高糖+姜黄素组（t=6.83，P=0.000）细胞增殖活力明显降低。与高糖组相比，高糖+姜黄素组细胞增殖活力明显升高（t=15.30，P=0.000）（图2）。以上实验结果表明，高浓度葡萄糖培养条件下RF/6A 细胞活力降低，姜黄素对高浓度葡萄糖条件下的细胞活力具有保护作用。

图2 CCK-8 检测各组RF/6A 细胞增殖活力的比较

2.3 姜黄素对RF/6A 细胞迁移的影响

Transwell 结果显示，不同处理组RF/6A 细胞的迁移数分别为：对照组（122.00±5.48）个、高糖组（142.00±10.18）个、高糖＋姜黄素组（76.50±7.56）个，3 组间比较差异具有统计学意义（F=106.35，P=0.000）。与对照组相比，高糖组细胞迁移数明显增多（t=4.24，P=0.002），高糖+姜黄素组细胞迁移数明显减少（t=11.94，P=0.000）。与高糖组相比，高糖+姜黄素组细胞迁移数明显减少（t=12.66，P=0.000）（图3）。

图3 Transwell 法检测各组RF/6A 细胞迁移能力（200×）。3A 对照组；3B 高糖组；3C 高糖+姜黄素组

2.4 姜黄素对RF/6A 细胞血管形成的影响

Matrigel 结果显示，不同处理组RF/6A 细胞的管腔形成数分别为：对照组（9.33±2.50）个、高糖组（14.83±3.06）个、高糖＋姜黄素组（6.33±1.37）个，3 组间比较差异具有统计学意义（F=19.11，P=0.000）。与对照组相比，高糖组细胞管腔形成数明显增多（t=3.41，P=0.007），高糖+姜黄素组细胞管腔形成数明显减少（t=2.58，P=0.028）。与高糖组相比，高糖+姜黄素组细胞管腔形成数明显减少（t=6.21，P=0.000）（图4）。

血管分支长度比较：对照组（3169.67±270.81）μm、高糖组（3606.67±325.15）μm、高糖＋姜黄素组（2556.50±301.72）μm，3 组间比较差异具有统计学意义（F=18.55，P=0.000）。与对照组相比，高糖组血管分支长度明显增加（t=2.53，P=0.030），高糖+姜黄素组血管分支长度明显减小（t=3.71，P=0.004）。与高糖组相比，高糖+姜黄素组血管分支长度明显减小（t=5.80，P=0.000）（图4）。

图4 Matrigel 法检测各组RF/6A 细胞血管形成能力（×100）。4A 对照组；4B 高糖组；4C 高糖+姜黄素组；4D 各组RF/6A 细胞的管腔形成数比较；4E 各组RF/6A 细胞的血管分支长度比较

3 讨论

DR 是糖尿病患者最常见的微血管并发症，是世界范围内不可逆致盲的主要原因[5]。从上世纪90年代以来，随着人民生活水平的提升，此并发症的发生率也在逐年攀升[6]。近年来抑制DR 晚期出现的病理性视网膜新生血管的药物不断涌现，给大部分患者带来了福音，但并非所有患者均能得到有效治疗[7]，因而寻求其他的治疗方法意义重大。本研究结果提示，高浓度葡萄糖培养明显降低了RF/6A 细胞活力，导致其细胞增殖能力下降，与文献报道的结果一致[8-10]。给予姜黄素处理后，可明显增强高浓度葡萄糖培养条件下的RF/6A 细胞增殖活力，其机制可能与高糖增加细胞的氧化应激，而姜黄素通过抑制氧化应激水平保护细胞免受高糖的损伤有关[9]。此外，姜黄素具有明显的抗炎作用，能够减少高浓度葡萄糖诱导的肿瘤坏死因子α （tumor necrosis factor-α,TNF-α）表达，同时也与姜黄素抑制细胞凋亡、维持高糖条件下的细胞活力有关[10]。最近研究[11]发现，姜黄素能显著降低人视网膜色素上皮细胞中的活性氧簇（reactive oxygen species,ROS）浓度和高浓度葡萄糖培养下人视网膜内皮细胞TNF-α 的释放，还能维持视网膜周细胞活力免受高糖损伤，以上报道均与本研究结果相符。综上，姜黄素通过抗氧化应激和抗炎作用对高浓度葡萄糖条件下的视网膜内皮细胞损伤起到抑制作用，从而保护视网膜内皮细胞，维持细胞活力。

新的血管网络是由先前存在的血管通过血管生成的过程发展而来，视网膜新生血管是增殖性DR（proliferative diabetic retinopathy,PDR）的重要特征，其特点是血管生成异常导致缺氧和血管渗漏[3]。缺氧等代谢障碍损伤糖尿病患者视网膜组织，引起视网膜炎症，进而血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）的表达增多，促进新血管形成。由于糖尿病视网膜内皮细胞和周细胞的快速凋亡，严重破坏了视网膜微血管的平衡，导致进行性血管变性[12-13]。内皮细胞损伤伴随着视网膜内屏障的破坏和生长因子、细胞因子和趋化因子的局部释放，这些因子通过直接作用于内皮细胞或通过炎症细胞产生诱导血管生成的因子而间接发挥促血管生成活性[14-15]。本研究发现高浓度葡萄糖明显抑制内皮细胞RF/6A的活力，进而促进细胞迁移和血管形成，与文献报道一致。VEGF 作为介导缺血诱导的视网膜新生血管形成的主要血管生成因子，是治疗和干预PDR 的重要靶点。不过，虽然VEGF 拮抗剂对新生血管的改善效果良好，但在缺血条件下抑制新生血管可能会导致持续的视网膜缺血。此外，VEGF 对其他视网膜细胞具有保护作用，抗新生血管治疗废除了VEGF 的这一生理功能可能会带来副作用[16-17]。尽管VEGF 拮抗剂具有强大的抗VEGF 特性，但它并不能完全抑制视网膜纤维血管化，在严重的PDR 病例中，也有关于玻璃体腔注射贝伐单抗后发生牵拉性视网膜脱离的报道[18]。因此，可能有其他各种因素参与DR 所涉及的纤维化和血管生成过程，研究抗VEGF 以外的其他治疗策略很有必要。

姜黄素是从姜黄、莪术、郁金等植物根茎中提取的多酚类化合物，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、免疫调节等广泛药理作用，且毒性极低，自古以来被许多国家广泛用于预防和/或治疗多种疾病。近年来在肿瘤方面的研究中，姜黄素表现出明显的抑制血管生成特性。例如，在肝癌的体内体外实验中，姜黄素可明显抑制人脐静脉内皮细胞的血管生成，与降糖药二甲双胍联合应用后效果更为显著[19]。在结直肠癌的研究中发现，植物体姜黄素通过调控VEGF 信号通路诱导氧化应激和抑制血管生成，从而发挥抗肿瘤作用[20]。同样，在恶性胸膜间皮瘤的研究中，姜黄素可以诱导小鼠恶性间皮瘤细胞的凋亡，抑制细胞活性；在肿瘤的小鼠模型中，姜黄素可明显抑制肿瘤血管生成[21]。本研究观察了姜黄素对高浓度葡萄糖培养条件下RF/6A 细胞迁移和血管生成的影响，结果提示姜黄素对高糖诱导的细胞迁移和血管生成具有显著的抑制作用，与肿瘤血管生成方面的研究结果相似。另有研究表明，姜黄素可通过调控内皮祖细胞促进新生血管形成，在缺血再灌注损伤（ischemia-reperfusion injury,IRI） 中发挥保护作用。在心肌IRI 模型中，姜黄素能显著增加VEGF 分泌，从而促进新生血管形成[22]。在1 型糖尿病小鼠疾病模型中，姜黄素可显著改善缺血后肢的血流再灌注和毛细血管密度；同时姜黄素的应用增强了内皮祖细胞的增殖、迁移能力，促进新生血管形成，机制与姜黄素治疗后内皮祖细胞中VEGF-A 和血管紧张素-1 表达增多有关[23]。综上，姜黄素对血管新生可能通过双向调节机制发挥保护作用，即在组织缺血状态下，姜黄素刺激新生血管形成，改善缺血组织的血供；在病理条件下，姜黄素抑制新生血管形成，减轻病理性新生血管的继发组织损害，改善疾病预后。

近年来研究表明，姜黄素是一种有效的治疗眼前节疾病的候选药物，其效应主要包括角膜疾病中的抗血管生成作用；干眼、结膜炎、前葡萄膜炎中的抗炎、抗过敏作用；翼状胬肉中的抗增殖和促凋亡作用；白内障中的抗氧化应激、抗渗透应激、抗脂质过氧化、促细胞凋亡、调节钙稳态、隔离自由基、蛋白修饰及降解作用以及青光眼中的神经保护作用等[24]。此外，脉络膜新生血管的细胞和动物模型研究也提示，姜黄素能通过抑制炎症和血管生成过程明显抑制疾病的进展[25]。由于其抗氧化和抗炎等特性，在合理配制的情况下（考虑到其眼部生物利用度和在视网膜的分布），姜黄素对视网膜疾病的治疗具有一定的临床应用价值[11,26]。总之，本研究提示姜黄素在治疗DR，尤其是PDR 方面具有临床应用前景，姜黄素对视网膜血管生成影响的具体机制还需要进一步研究。