miR-130a靶向调控FOSL1基因对胰腺癌PANC-1细胞增殖和凋亡的影响及机制

曾凯，何磊，葛萍萍，范东，许利剑

南京医科大学第二附属医院，南京210003

胰腺癌是消化系统肿瘤，恶性程度极高，是全世界癌症相关死亡的第四大主要原因，2018年统计数据显示，全世界约有45.8万例胰腺癌新发病例以及约43.2万例与胰腺癌相关的死亡病例，且胰腺癌的发病率和病死率最近显示出持续增加的趋势[1]。虽然随着医疗技术的进步，胰腺癌的治疗手段在不断提升，但患者的预后仍较差，总体5年相对存活率仅约5%[2]，因此迫切需探索新的治疗手段提高胰腺癌患者生存率，而胰腺癌的发病机制尚未明确，在分子水平研究胰腺癌的进展机制是寻找治疗靶点的重要途径。微小RNA( miR-130a) 密切参与正常和恶性组织的各种生理过程，在肿瘤疾病中miR-130a显示出双重作用，即表达升高发挥促癌作用和表达降低发挥抑癌作用，具有成为抗肿瘤治疗靶点的潜力[3～6]。但miR-130a在胰腺癌中的表达及作用未知，研究报道，miR-130a在胰腺癌癌前病变高风险的胰腺癌导管内乳头状黏液性肿瘤(IPMNs)中表达下调，推测miR-130a在胰腺癌中发挥抑癌基因的作用[7]。2018年6月～2019年8月，我们探讨了miR-130a通过靶向调控FOS样抗原1(FOSL1)对胰腺癌细胞增殖和凋亡的影响及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 胰腺癌细胞PANC-1 (中国科学院，上海)；RPMI1640培养基、FBS、青链霉素(Giboc，美国)；DP501 miRcute miRNA 提取试剂盒(天根，中国北京)；TaqMan miRNA反转录试剂盒 (ABI，美国)；RT-PCR试剂盒(TaKaRa，日本)；miR-130a、FOSL1、内参U6和GAPDH引物(Invitrogen，美国)；miR-130a mimic、过表达FOSL1质粒、pGLO-FOSL1-(野生型)和pGLO-FOSL1-mut (突变型) (吉凯，中国上海)；CCK8试剂(GlpBio，美国)；流式细胞凋亡检测试剂盒(凯基生物，中国南京)；双荧光素酶报告基因试剂盒 (碧云天，中国上海)；蛋白裂解液(索莱宝，中国北京)；FOSL1和p53抗体(Abcam，英国)。

1.2 细胞培养和转染 胰腺癌细胞PANC-1快速复苏后重悬至含有10%FBS、0.1%青链霉素的RPMI1640培养基中。细胞长至90%时，胰酶消化后传代，以20万个细胞铺至6孔板中，分为NC组和miR-130a mimic组，细胞贴壁12 h时采用脂质体2000将质粒转染至细胞中，NC组转染对照，miR-130a mimic组转染miR-130a模拟物，用于后续miR-130a的功能研究。同时分为NC组、miR-130a mimic组和miR-130a mimic+oe-FOSL1(过表达FOSL1质粒)共转染组，细胞贴壁12 h时采用脂质体2000将质粒转染至细胞中，NC组转染对照，miR-130a mimic组转染miR-130a模拟物，miR-130a mimic+oe-FOSL1组转染miR-130a模拟物和FOSL1过表达质粒。用于后续miR-130a 靶向FOSL1的功能研究。

1.3 miR-130a和FOSL1 mRNA表达检测 采用qRT-PCR法。收集NC组、miR-130a mimic组和miR-130a mimic+oe-FOSL1组胰腺癌PANC-1细胞，采用DP501 miRcute miRNA提取试剂盒获得细胞总RNA，分光光度计检测RNA浓度后，将其逆转录为cDNA。以cDNA为模板，根据SYBR Premix EX TaqTMⅡ试剂盒说明书配制反应体系，并以95 ℃预变性5 s，95 ℃变性5 s、65 ℃退火30 s,40个循环，PCR扩增，检测各样品的循环阈值(Ct)，以2-ΔΔCt公式计算miR-130a相对表达量(U6为内参)和FOSL1 mRNA相对表达量(GAPDH为内参)。miR-130a正向引物:5′-TTGCGATTCTGTTTTGTGCT-3′,反向引物:5′-GTGGGGTCCTCAGTGGG-3′。U6正向引物:5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′,反向引物:5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′。FOSL1正向引物:5′-CAGGCGGAGACTGACAAACTG-3′,反向引物:5′-TCCTTCCGGGATTTTGCAGAT-3′。GAPDH正向引物:5′-TGTGGGCATCAATGGATTTGG-3′,反向引物:5′-ACACCATGTATTCCGGGTCAAT-3′。

1.4 细胞增殖能力检测 采用CCK-8法。将2 000个胰腺癌细胞PANC-1接种至96孔板中，按上述1.2分组的方法进行各组细胞的转染。在转染的第0、24、48和72 h时每孔加入10 μL CCK-8试剂，放置培养箱中1 h后，采用酶标仪检测波长450 nm处OD值。

1.5 细胞凋亡率测算 采用流式细胞仪检测细胞凋亡。收集转染48 h的各组细胞及上清液，离心PBS洗3次后，重悬至500 μL的染色缓冲液中,分别加入5 μL的Annexin V-FITC和PI染色进行染色，5 min后采用流式细胞仪上机检测。

1.6 荧光素酶活性检测 采用双荧光素酶报告基因实验验证miR-130a 的FOSL1靶向调控关系。TargetScan7.1软件(http://www.targetscan.org/)预测miR-130a的靶基因。将3 000个胰腺癌细胞PANC-1接种到96孔板中，分为FOSL1-wt+NC组、FOSL1-wt+miR-130a mimic组、FOSL1-mut+NC组和FOSL1-mut+miR-130a mimic组，细胞贴壁12 h，采用脂质体2000将质粒转染至细胞中，FOSL1-wt+NC组转染FOSL1野生型质粒和对照，FOSL1-wt+miR-130a mimic组转染FOSL1野生型质粒和miR-130a模拟物，FOSL1-mut+NC组转染FOSL1突变型质粒和对照，FOSL1-mut+miR-130a mimic组转染FOSL1突变型质粒和miR-130a模拟物。采用双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测转染48 h各组细胞的荧光素酶活性。

1.7 FOSL1、p53蛋白表达检测 采用Western blotting法。收集转染48 h的各组细胞斑块，加入蛋白裂解液吹打，完全裂解后在低温条件下超高速离心，检测蛋白浓度后，煮沸变性，凝胶电泳，转膜，封闭液封闭2 h，一抗4 ℃孵育过夜，二抗室温孵育1 h，ECL化学发光法曝光。目标蛋白相对表达量=目标蛋白灰度值/GAPDH灰度值。实验重复3次，取平均值。

2 结果

2.1 NC组、miR-130a mimic组miR-130a表达比较 miR-130a在NC组、miR-130a mimic组PANC-1细胞中的相对表达量分别为1.00±0.00、8.24±0.89，与NC组相比，miR-130a mimic组细胞中miR-130a表达增加(t=14.091,P<0.05)。

2.2 NC组、miR-130a mimic组细胞增殖能力比较 CCK-8实验检测结果显示，与NC组相比，miR-130a mimic组细胞增殖能力降低，且随着转染时间的增加，两组间的增殖差异越明显(P<0.05)。见表1。

2.3 NC组、miR-130a mimic组细胞凋亡率比较 NC组、miR-130a mimic组早期凋亡率分别为1.35%±0.04%、7.98%±0.35%，晚期凋亡率分别为3.54%±0.28%、4.05%±0.21%，与NC组相比，miR-130a mimic组细胞早期凋亡率增加(t=32.598,P<0.001)，晚期凋亡率比较差异无统计学意义(t=2.524,P=0.053)。

表1 NC组和miR-130a mimic组不同时点细胞增殖活力比较(OD值,

注：与NC组相比，*P<0.05。

2.4 miR-130a对FOSL1的靶向调控作用 TargetScan7.1软件在线预测显示，miR-130a与FOSL1启动子区具有结合位点，见图1。双荧光素酶报告基因试验结果显示，FOSL1-wt+NC组、FOSL1-wt+ miR-130a组、FOSL1-mut+NC组、FOSL1-mut+miR-130a组的荧光素酶活性分别为1.00±0.09、0.39±0.08、1.00±0.02、0.93±0.12，与FOSL1-wt+NC组相比，FOSL1-wt+ miR-130a组的荧光素酶活性降低(P<0.05)，而FOSL1-mut+NC和FOSL1-mut+miR-130a组间的荧光素酶活性差异无统计学意义。与NC组(1.00±0.00)相比，miR-130a mimic组FOSL1 mRNA的相对表达量(0.23±0.08)降低，差异有统计学意义(P<0.05)。

图1 miR-130a与FOSL1的结合位点

2.5 miR-130a靶向FOSL1对PANC-1细胞增殖能力的影响 见表2。

表2 NC组、miR-130a mimic组和miR-130a mimic+oe-FOSL1组不同时点细胞增殖活力比较(OD值,

注：与NC组相比，*P<0.05；与miR-130a mimic组相比，#P<0.05。

2.6 miR-130a靶向FOSL1对PANC-1细胞凋亡能力的影响 流式细胞仪实验检测结果显示，NC组、miR-130a mimic组和miR-130a mimic+oe-FOSL1组早期凋亡率分别为1.06%±0.08%、9.04%±0.42%、7.98%±0.35%，晚期凋亡率分别为4.65%±0.19%、5.84%±0.14%、5.01%±0.34%，与NC组相比，miR-130a mimic组和miR-130a mimic+oe-FOSL1组细胞早期凋亡率升高(t分别为32.328、33.384,P均<0.05)。而与miR-130a mimic 组相比，miR-130a mimic+oe-FOSL1组细胞凋亡率降低(t=3.358,P=0.020)。

2.7 miR-130a调控FOSL1对p53蛋白表达的影响 NC组、miR-130a mimic组和miR-130a mimic+oe-FOSL1组FOSL1蛋白相对表达量分别为1.12±0.07、0.23±0.04、0.85±0.07，p53蛋白相对表达量分别为0.19±0.10、1.84±0.18、0.95±0.09，与NC组相比，miR-130a mimic组和miR-130a mimic+oe-FOSL1组细胞中FOSL1蛋白表达降低(t分别为19.120、4.724，P均<0.05)、p53蛋白表达增加(t分别为13.879、9.784,P均<0.05)。而与miR-130a mimic组相比，miR-130a mimic+oe-FOSL1组细胞中FOSL1蛋白表达增加(t=13.320,P<0.001)、p53蛋白表达降低(t=7.661,P=0.001)。见图2。

图2 miR-130a靶向调控FOSL1促进p53蛋白表达

3 讨论

胰腺癌属于高度恶性肿瘤之一，被称为“癌中之王”，严重威胁患者生命健康[1]。胰腺癌的治疗包括根治性手术切除、化学治疗、放射治疗等肿瘤传统治疗手段[8，9]，但由于胰腺癌起病具有隐匿性，早期诊断率极低，多数患者失去了根治性手术切除机会，且胰腺癌具有侵袭性和转移性强的特点，使得疾病进展迅速，对化学疗法和放射疗法的抵抗力强，研究数据显示,60%的PC患者在诊断时有远处转移，只有10%～15%的患者有手术机会，这导致在过去几十年胰腺癌患者的存活率未见明显升高[2]。临床实践中新型分子靶向药物在抗肿瘤治疗中取得了显著疗效，近年来分子靶向药物包括血管生成通路、表皮生长因子受体通路和KRAS通路等相关抑制剂亦在胰腺癌的治疗中取得一定进展[10]，但目前的治疗未达到理想的效果，因此，迫切需探索治疗胰腺癌的新靶点。

miRNA是长度约为22个核苷酸的非编码小RNA，是诸多生物学过程的关键调节剂，如细胞增殖和分化、代谢和细胞活化，大量miRNA已被证明在包括胰腺癌的几乎所有肿瘤中表达异常，并且密切参与肿瘤的恶性进展[11]。越来越多的研究已证实,miR-130a是与肿瘤发病机理密切相关的miRNA之一，在直肠癌和宫颈癌等肿瘤中表达增加，促进放射敏感抗性、增殖和侵袭等肿瘤恶性行为[3，4]，在肝细胞肝癌和神经胶质瘤细胞等恶性肿瘤中表达减少，抑制肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移能力，促进细胞发生凋亡[5，6]。Permuth-Wey等[7]报道与低风险IPMNs相比，高风险IPMNs全基因组miRNA表达谱分析显示，miR-130a和miR-100等6个miRNA表达下调，并且其致癌靶标表达上调，高风险IPMNs是胰腺癌的前体，提示miR-130a可能在胰腺癌中发挥重要作用，因此本研究在细胞水平研究了miR-130在胰腺癌中发挥的生物学功能。凋亡和增殖是调节细胞状态控制途径的两种主要机制，是肿瘤细胞的两大重要表型，被认为是抗肿瘤治疗的靶向策略[12]。本研究应用miR-130a mimic转染胰腺癌细胞PANC-1，并成功过表达胰腺癌细胞中miR-130a后，CCK8和凋亡实验发现，过表达miR-130a后，胰腺癌细胞的增殖能力降低、细胞凋亡增多。与Ye等[13]报道miR-130a在非小细胞肺癌中抑制细胞生长并增强细胞凋亡的研究结果一致，表明miR-130a在胰腺癌中发挥抑癌因子的作用。

miRNA虽然不具备编码蛋白质功能，但其可通过诱导其靶mRNA的切割或阻止其翻译成蛋白质在转录后水平抑制基因的表达发挥其调控作用[11]。因此我们进一步探索了miR-130a在胰腺癌中发挥作用的靶基因，TargetScan7.1软件预测提示,FOSL1基因是miR-130a的靶基因，FOSL1在骨肉瘤和前列腺癌等肿瘤中被报道为肿瘤促癌基因[14,15]，研究发现，FOSL1高表达预示突变型KRAS肺癌和胰腺癌患者存活率较差[16]。并且新型多激酶抑制剂LY-1816通过下调FOSL1的表达抑制胰腺导管腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力，并诱导细胞凋亡[17]。miR-130a的过表达通过靶向抑制FOSL1的水平降低浸润性乳腺癌细胞的迁移和侵袭能力[18]。因此miR-130a可能通过靶向负调控癌基因FOSL1抑制胰腺癌的进展。本研究采用双荧光素酶报告基因试验证实FOSL1为miR-130a的靶基因，qRT-PCR结果显示，FOSL1 mRNA在过表达miR-130a的胰腺癌细胞中表达降低，表明miR-130a在胰腺癌细胞中负靶向调控FOSL1的表达，与在乳腺癌中的研究相似[18]。但miR-130a是否通过负调控FOSL1抑制胰腺癌细胞的增殖能力和促进细胞的凋亡有待探讨。本研究采用过表达FOSL1质粒转染miR-130a mimic胰腺癌细胞，研究FOSL1对miR-130a生物学功能的影响，结果显示过表达FOSL1可减弱miR-130a对胰腺癌细胞PANC-1的增殖抑制作用和凋亡的促进作用。表明miR-130a通过FOSL1发挥生物学功能。p53属于经典的抑癌基因，具有抑制细胞增殖和促进细胞凋亡的重要生物学功能[19，20]。本研究发现，miR-130a促进胰腺癌细胞中p53的表达，而过表达miR-130a可减弱miR-130a对p53蛋白表达的促进作用，因此miR-130a靶向FOSL1可能通过促进抑癌基因p53的表达抑制胰腺癌的恶性进程。

综上所述，miR-130a通过靶向抑制FOSL1降低胰腺癌细胞的增殖能力和促进细胞的凋亡发生，进一步的作用机制可能通过促进p53的表达发挥生物学功能。miR-130a可能是治疗胰腺癌的潜在分子靶点。