miR-129-5p在胃癌组织、细胞系中表达及其对细胞增殖和侵袭能力的影响

戴春，于永进，谭明，丁永斌

1扬中市人民医院，江苏扬中212200；2江苏省人民医院

胃癌是全球癌症相关死亡的第二大原因，最新统计显示，每年约有951 600例新发病例和723 100例死亡病例[1]。胃癌常用的治疗手段是手术切除、辅助放化疗和生物治疗，但复发和转移率高，患者生存率低[2]。微小RNA(miRNA)是短链非编码RNA，通过结合靶mRNA发挥转录后调控[3,4]。miRNA通过调节其下游靶标参与胃癌进展，是胃癌发生和进展的关键调节因子[5]。miR-129-5p在多种肿瘤如膀胱癌[6]﹑结肠癌[7]﹑喉癌[8]及胃癌[9,10]中发挥抑癌作用。2018年1月～2019年1月，我们检测了miR-129-5p在胃癌及癌旁正常组织中的表达，并探讨其对细胞增殖和侵袭能力的影响。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取扬中市人民医院普外科于2015年1月～2016年1月行根治性胃癌切除术(R0切除术)且术后病理诊断为胃癌的70例患者，收集其术中切除的癌及癌旁正常组织(距离肿瘤组织1 cm)标本，置于液氮中快速冷冻并储存于-80 ℃中。患者纳入标准：①经术后病理检查诊断为胃癌；②术前未接受任何放化疗或生物治疗；③患者不存在除胃癌之外的其他恶性肿瘤；④具有完整的随访资料。排除标准：①不符合上述纳入标准；②临床或随访资料不全。患者男42例、女28例，年龄(53.4±10.9)岁。肿瘤直径<3 cm者38例，≥3 cm者32例；组织分化程度为高分化20例，中分化26例，低分化24例；TNM分期为Ⅰ期19例，Ⅱ期20例，Ⅲ期20例，Ⅳ期11例；淋巴结转移31例。本研究标本收集于医院胃癌标本库，经医院伦理委员会批准同意。患者或其家属均签署知情同意书。

1.2 细胞系培养 实验所用的人胃癌细胞系(SGC-7901、MKN-45和BGC-823)和正常胃黏膜细胞系(GES-1细胞)购自中国科学院细胞库(中国上海)。所有细胞于Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM，GIBCO，Carlsbad，CA，USA)中培养，并补充含10%胎牛血清(GIBCO，Carlsbad，CA，USA)在培养箱中于37 ℃和5%CO2条件下培养。将BGC-823细胞(1×105)接种于6孔板中，并在37 ℃和5%CO2的培养箱中培养24 h。

1.3 胃癌、癌旁组织及细胞系中miR-129-5p表达检测 采用实时荧光定量PCR法。使用TRIzol试剂(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)，根据制造商说明书分离来自组织和细胞的总RNA。使用PrimeScript RT Reagent Kit(TaKaRa，Dalian，China)将500 ng总RNA逆转为cDNA。使用ABI 7900HT PCR系统(Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)和SYBR Premix Ex Taq(TaKaRa，大连，中国)检测miR-129-5p表达。用2-ΔΔCt法计算miR-129-5p相对表达量，以U6小核为内参。miR-129-5p正向引物：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′,反向引物:5′-ATTCGCACTGGATACGACGCAAGC-3′。U6小核正向引物：5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，反向引物：5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′。根据胃癌组织中miR-129-5p的中位表达量，将患者分为miR-129-5p高表达组34例和miR-129-5p低表达组36例。

1.4 细胞分组及转染 取对数期BGC-823细胞系，将其分成miR-129-5p mimic组、miR-129-5p inhibitor组及miR-NC组，使用Lipofectamine 3000(Invitrogen)分别将miR-129-5p模拟物、miR-129-5p抑制剂或miR-129-5p阴性对照序列Scramble转染对数期BGC-823细胞系。miR-129-5p模拟物、miR-129-5p抑制剂或miR-129-5p阴性对照序列Scramble (NC)由上海吉玛生物科技有限公司合成。

1.5 细胞增殖能力测定 采用CCK-8实验。将miR-129-5p mimic组、miR-129-5p inhibitor组及miR-NC组细胞(2 000个细胞/板)接种于96孔板(Costar，CA，USA)中。将细胞再培养1、2、3 d后，根据制造商说明书，使用Cell Counting Kit-8测定试剂盒(CCK-8，Dojindo，Kumamoto，Japan)检测细胞生长情况,使用Bio-Rad酶标仪(Hercules，CA，USA)测量波长450 nm处的光密度(OD)，实验重复3次。采用细胞集落形成实验统计各组细胞集落数目。

1.6 细胞侵袭能力测定 使用8 μm孔径的24孔Transwell小室(Corning Incorporated，Corning，NY，USA)测定细胞侵袭能力，用Matrigel(BD Biosciences，Bedford，MA)预涂覆。将1×105转染细胞加入含有200 μL无血清DMEM培养基的上部小室中，在下部小室中，添加含10%FBS的600 μL DMEM培养基。转染48 h后，将下部Transwell小室上的细胞固定于100%甲醇中，并用结晶紫染色，选择并计算5个随机区域穿膜细胞数。

1.7 随访 采用门诊或电话随访，每3个月或半年随访1次，随访内容包括肿瘤复发及死亡等内容，随访截止时间为2019年1月，总生存时间从第一次手术当天至死亡或随访的最后1 d计算。

2 结果

2.1 miR-129-5p在胃癌、癌旁正常组织及细胞系中表达比较 miR-129-5p在胃癌、癌旁正常组织中的相对表达量分别为0.85±0.14、2.23±0.25,二者比较，P<0.01。胃癌细胞系MKN-45、BGC-823和SGC-7901中miR-129-5p的相对表达量分别为0.62±0.03、0.41±0.04、0.83±0.06，正常胃黏膜细胞系GES-1中miR-129-5p的相对表达量为1.02±0.04，三种胃癌细胞系中miR-129-5p的相对表达量低于GES-1细胞系(P均<0.01)。

2.2 miR-129-5p表达与胃癌患者临床病理特征及预后的关系 miR-129-5p表达与肿瘤大小和淋巴结转移有关(P均<0.05)，与患者年龄﹑性别﹑组织分化程度及TNM分期无关(P均﹥0.05)，见表1。生存分析结果显示，miR-129-5p低表达组、miR-129-5p高表达组1年总生存率分别为63.5%、82.1%,miR-129-5p低表达组1年总生存率低于miR-129-5p高表达组(Log rank=23.34,P<0.001)。

表1 miR-129-5p表达与胃癌患者临床病理特征的关系(例)

2.3 MiR-129-5p过表达对胃癌细胞增殖的影响 转染后24 h，miR-129-5p mimic组、miR-NC组、miR-129-5p inhibitor组OD值分别为1.03±0.03、1.93±0.05、2.25±0.08,三组比较，P<0.01；转染后48 h OD值分别为1.22±0.03、2.31±0.06、3.02±0.18,三组比较，P<0.01；转染后72 h OD值分别为2.25±0.03、3.11±0.06、4.02±0.15,三组比较，P<0.01。细胞集落形成实验结果显示，miR-129-5p mimic组、miR-NC组、miR-129-5p inhibitor组细胞集落数目分别为(42±5)、(68±7)、(210±13)个,三组比较，P<0.01。

2.4 miR-129-5p过表达对胃癌细胞侵袭的影响 miR-129-5p mimic组、miR-NC组、miR-129-5p inhibitor组侵袭细胞数分别为(20±3)、(48±5)、(82±3)个，三组比较,P<0.01。

3 讨论

胃癌是起源于胃黏膜上皮的恶性肿瘤，男女发病比例为2∶1，由于饮食结构的改变、工作压力增大及幽门螺杆菌感染等原因，胃癌发病呈现年轻化倾向，且晚期胃癌患者预后差[11]。文献报道，诸多miRNA和长链非编码RNA参与了肿瘤细胞增殖、迁移、侵袭和转移过程[12,13]，是胃癌发生发展的重要调节分子。在前列腺癌[14]中，miR-129-5p呈低表达，可通过靶向下调ETV1表达抑制细胞增殖。在肺癌[15]中，miR-129-5p起抑癌基因作用，上调表达可抑制细胞增殖，促进细胞凋亡。在宫颈癌[16]中，miR-129-5p靶向结合ZIC2，抑制Hedgehog信号通路，抑制细胞迁移和侵袭。研究显示，miR-129-5p在胃癌中表现为抑癌作用，miR-129-5p过表达可降低胃癌细胞系SGC7901/ADR化疗耐药性[17]。miR-129-5p在胃癌中表达下调，并通过靶向白细胞介素-8参与细胞迁移和侵袭[9]。miR-129-5p过表达通过与3′非翻译区(3′UTR)结合而靶向SPOCK1，进而抑制SGC-7901细胞活力、增殖、迁移和侵袭[18]。本研究发现,与癌旁正常组织相比，胃癌组织中miR-129-5p表达下调，与上述报道[9,14,15]存在一致性，提示miR-129-5p为潜在肿瘤抑制因子。

本研究结果显示,miR-129-5p低表达与胃癌肿瘤大小、淋巴结转移和预后不良有关，提示miR-129-5p 不仅与肿瘤负荷、侵袭能力相关，同时提示其可作为预测胃癌患者不良预后的潜在分子标志物。本研究结果显示，miR-129-5p mimic组OD值低于miR-NC组，miR-129-5p inhibitor组OD值高于miR-NC组；miR-129-5p mimic组细胞集落数少于miR-NC组，miR-129-5p inhibitor组细胞集落数多于miR-NC组，差异均有统计学意义，表明miR-129-5p表达上调可显著抑制胃癌细胞增殖和克隆形成。此与Yan等[18]报道结果一致。

侵袭转移是肿瘤细胞恶性表型特征之一。肿瘤细胞从原发灶，经与周围的上皮细胞黏附减弱，与间质来源细胞黏附增强，最终从上皮脱落，穿过基底膜，形成远处转移灶[19]。本研究发现，miR-129-5p mimic组侵袭细胞数少于miR-NC组，miR-129-5p inhibitor组侵袭细胞数多于miR-NC组，差异均有统计学意义，表明miR-129-5p表达上调可显著抑制胃癌细胞侵袭，反之，敲低miR-129-5p表达可促进胃癌细胞侵袭。此说明miR-129-5p起肿瘤抑制作用，miR-129-5p低表达与肿瘤大小、淋巴结转移等恶性病理学特征及预后不良有关。

综上所述，胃癌患者癌、癌旁正常组织及细胞系中miR-129-5p表达均下调，且miR-129-5p表达下调表达与胃癌患者不良预后有关，miR-129-5p高表达可抑制细胞增殖和侵袭，miR-129-5p在胃癌中发挥肿瘤抑制作用，可能是胃癌治疗的潜在靶点。