小鼠胚胎玻璃化冷冻方法的改进研究

高 妍，郝金栋，袁 宝，姜 昊，陈承祯，张嘉保

（吉林大学 动物科学学院，长春 130062）

虽然胚胎玻璃化冷冻技术已趋于成熟和稳定，但降低冷冻损伤、简化操作步骤、提高冷冻效率仍是当前研究的热点。1970年，研究人员在深海鱼的血清中发现了抗冻蛋白［1］，这种蛋白能通过非共价吸附到冰核表面，抑制冰晶生成和重结晶，减少机体因结冰引起的损害［2］。抗冻蛋白已经广泛应用到食品加工［3］、农作物抗冻［4］、胚胎以及精液冷冻［5］中，并取得了良好的抗冻效果。抗冻蛋白Ⅲ（AFPⅢ）是一种主要存在于绵尉亚科鱼类的球蛋白，其亲水残基的氢键与冰晶有较好的结合力，可以减少降温过程中冰晶的生成而起到冷冻保护作用。试验将AFPⅢ应用于小鼠囊胚玻璃化冷冻，并采用两步、三步解冻法解冻，观察冷冻效果，为改良玻璃化冷冻方法、提高冷冻效率奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验动物

SPF级雌性ICR小鼠30只、雄性ICR小鼠10只，饲养于吉林大学实验动物中心［SCXK（吉）2016－0001］。饲养环境温度为25℃，相对湿度为50%～60%，每日光照12 h。试验设计获得吉林大学实验动物伦理委员会批准，严格按照动物使用指南进行并给予试验动物人道主义关怀。

1.2 主要试剂与仪器、用品

AFPⅢ，购自A／F Protein Inc公司；胎牛血清（FBS），购自Gibco公司；孕马血清（PMSG）和人绒毛膜促性腺激素（hCG），购自宁波第二激素厂；蔗糖、聚蔗糖、乙二醇（EG）、二甲基亚砜（DMSO）、M16培养液、M2操作液，均购自Sigma公司；CO2恒温培养箱，购自Thermo Fisher公司；小鼠取卵手术器械，购自上海医疗器械有限公司手术器械厂；胚胎冷冻管，购自青岛益然生物科技有限公司；液氮罐，购自河南天驰仪器设备有限公司。以上仪器及设备由吉林大学动物科学学院模式动物实验室提供。

1.3 试验步骤及方法

1.3.1 小鼠胚胎的获取与培养 取10只7周龄的ICR雌鼠，腹腔注射10 IU PMSG，48 h后注射10 IU hCG，与雄鼠合笼过夜。次日早晨检查阴道栓，将有阴道栓的雌鼠取出单独饲养，注射hCG，48 h后颈椎脱臼处死。用灭菌的手术器械取出雌鼠输卵管，用1 mL注射器划破，用口吸管收集2细胞期胚胎，转移至提前平衡的M16培养液滴中，置于37℃、5% CO2培养箱中培养，发育至囊胚期，用于冷冻试验。

1.3.2 玻璃化冷冻液和解冻液的配制 基础液（FS）：10%胎牛血清（FBS）＋90%杜氏磷酸盐缓冲液（dPBS）＋30%聚蔗糖 ＋0.5 mol／L蔗糖。预平衡液：10% EG＋10% DMSO。玻璃化冷冻液：EFS30为70% FS＋30% EG，EFS40为60% FS＋40% EG；EFSA30为EFS30＋500 ng／mL AFPⅢ，EFSA40为EFS40＋500 ng／mL AFPⅢ。解冻液1：含0.5 mol／L蔗糖的M2操作液；解冻液2：含0.25 mol／L蔗糖的M2操作液。

1.3.3 胚胎玻璃化冷冻 将囊胚分为4组，分别以EFS30、EFS40、EFSA30和EFSA40为冷冻液对小鼠囊胚进行玻璃化冷冻。具体方法：将准备好的囊胚用预平衡液处理5 min后，再用冷冻液处理1 min，然后按照图1步骤将胚胎装入0.25 mL细管中，直接投入液氮中保存。将冷冻后的胚胎用两步法进行解冻，统计每组胚胎解冻后的存活数和孵化数，计算存活率和孵化率。

1.3.4 胚胎的解冻及培养 用冷冻效果较好的冷冻液对胚胎进行玻璃化冷冻，然后将冷冻的胚胎分为2组，分别用两步法和三步法解冻。具体方法：将冷冻细管从液氮中取出，放入37℃水浴。待管中溶液溶解后剪掉封口端，推动棉栓使管中内容物流入解冻液中，在体视显微镜下回收胚胎。两步法是将回收的胚胎先移入解冻液1中复苏5 min，再移入新鲜的M16培养液复苏5 min；三步法是将回收的胚胎先移入解冻液1中复苏3 min，再移入解冻液2中复苏3 min，最后移入新鲜的M16培养液复苏3 min。解冻后的胚胎移入平衡好的M16培养液滴中，于37℃、5% CO2培养箱中培养，统计每组胚胎解冻后的存活数和孵化数，计算存活率和孵化率。

1.4 数据的统计分析

试验数据采用SPSS19.0软件进行统计分析，进行单因素方差分析，P＜0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 AFPⅢ对胚胎玻璃化冷冻效果的影响

结果见表1。

表1 小鼠囊胚玻璃化冷冻存活率和孵化率测定结果

由表1可以看出：EFSA30组存活率和孵化率分别为83.7%和75.2%，显著高于EFS30组（P＜0.05）；EFSA40组存活率和孵化率分别为56.3%和64.4%，显著高于EFS40组（P＜0.05）；EFSA30组存活率和孵化率显著高于EFSA40组（P＜0.05）。说明AFPⅢ可以提高冷冻胚胎的存活率和孵化率。由于冷冻液EFSA30的效果好于EFSA40，遂选用EFSA30进行下一步试验。

2.2 不同解冻方法对胚胎冷冻效果的影响

结果见表2。

表2 两种方法解冻后小鼠囊胚玻璃化冷冻存活率和孵化率测定结果

由表2可以看出，用三步法解冻后，囊胚存活率和孵化率分别为92.8%和83.3%，显著高于两步法（P＜0.05）。说明用冷冻液EFSA30对囊胚进行玻璃化冷冻后，用三步法解冻可以获得更多存活的胚胎。

3 讨论

3.1 AFPⅢ对胚胎玻璃化冷冻效果的影响

自玻璃化冷冻胚胎技术成功以来，人们一直为改进冷冻方法和冷冻液的配方做着不断的研究［6－8］。EFS30和EFS40冷冻液是在基础冷冻液中添加聚蔗糖作为冷冻保护剂，目前已经被广泛应用于小鼠胚胎的玻璃化冷冻中。传统的冷冻保护剂主要是一些人工合成的化学物品，而抗冻蛋白是存在于自然界中具有提高生物抗冻能力的蛋白质，它的发现为冷冻液的改良提供了新的思路。抗冻蛋白生物来源主要有鱼类［9］、植物类［10］、昆虫类［11］和微生物类［12］四种，其中鱼类抗冻蛋白由于发现较早，研究相对较多。AFPⅢ是鱼类抗冻蛋白中的一种，已经被证明可以应用于胚胎冷冻［13］。本试验结果表明，在传统冷冻液中添加AFPⅢ后，EFSA30组冷冻囊胚解冻后的存活率和孵化率为83.7%和75.2%，显著高于EFS30组（67.9%和61.3%）。EFSA40组冷冻囊胚解冻后的存活率和孵化率为56.3%和64.4%，显著高于EFS40组（51.7%和45.5%）。因此，AFPⅢ可以作为一种良好的保护剂用以提高胚胎玻璃化冷冻效率。

3.2 解冻方法对胚胎玻璃化冷冻效果的影响

在以往研究中发现，采用一步冷冻法，胚胎瞬间进入高渗的冷冻液，急剧脱水会对胚胎结构造成损害，因此两步冷冻法比一步冷冻法的冷冻效果好［14－15］。而在解冻方面却存在不同观点，不同实验室对两步法和三步法解冻各有偏好。此外，胚胎玻璃化冷冻效果还与冷冻时胚胎所处发育阶段有关，不同发育时期的胚胎应该选用适合该阶段的冷冻配方和方法［16－18］。本试验结果表明，在EFS30中添加AFPⅢ后，用三步法解冻玻璃化冷冻的囊胚存活率和孵化率显著高于两步法。这可能与三步法中多梯度溶液的缓冲作用有关。然而三步法是否适用于其他发育阶段的胚胎冷冻，还需要进一步研究探索。

4 结论

在冷冻液中添加AFPⅢ可以有效提高小鼠囊胚的玻璃化冷冻效果。此外，相对于两步解冻法，三步解冻法更适合于囊胚阶段胚胎玻璃化冷冻后的解冻过程，这为胚胎玻璃化冷冻方法的改进提供了新的思路和参考依据。