葛根芩连汤对临床产超广谱β-内酰胺酶大肠埃希菌的抑制作用▲

环 诚 王小平 寇 静 冯 昭

(陕西中医药大学医学技术系，陕西省咸阳市 712046，电子邮箱：1318807324@qq.com)

大肠埃希菌是人的正常菌群中的常见条件致病菌。大肠埃希菌是医院感染的重要致病菌之一,是革兰阴性杆菌中有代表性的产超广谱β-内酰胺酶(extended-spectrum β-lactamases，ESBLs)菌种之一，临床上大肠埃希菌的耐药性较严重[1-3]。大肠埃希菌对许多抗生素都具有耐药性，目前，临床上使用亚胺培南等碳青霉烯类抗菌药物治疗大肠埃希菌感染，但是此类抗菌药物价格高昂，抗菌范围广，易导致菌群失调，因此仅适用于感染严重的患者[4]。

由于极少有细菌对中药产生耐药性[5]，临床上中药复方对耐药细菌感染的治疗效果相对西药更具优势。葛根芩连汤源自《伤寒论》，是东汉末年张仲景的经典名方。该方由葛根、黄芩、黄连、炙甘草4味中药组成，具有轻清解肌、清热止痢的功效，其在临床上不仅可用于治疗菌痢、轮状病毒性肠炎、抗生素相关性肠炎、溃疡性结肠炎、肠易激综合征，还可用于治疗糖尿病、高血压等慢性疾病[6]。本实验通过分析葛根芩连汤对产ESBLs的大肠埃希菌和不产ESBLs标准菌株的体外抑菌作用，探讨葛根芩连汤是否可通过调整肠道或肠道外的菌群来发挥治疗肠道感染的作用。

1 材料和方法

1.1 试剂和仪器 MH营养琼脂(批号：02-275)购自北京澳博星生物技术有限责任公司；营养肉汤(批号：02-013)购自北京澳博星生物技术有限责任公司；722E型可见分光光度计购自上海光谱仪器有限公司；9080型隔水式恒温培养箱购自上海一恒科技有限公司；FA1104N型电子天平购自上海精密科学仪器有限公司；DHG-9140A型电热恒温鼓风干燥箱购自上海一恒科技有限公司；TS-100C型恒温摇床购自上海天呈实验仪器制造有限公司；BBS-SDC型洁净工作台购自济南鑫贝西生物技术有限公司；YJT-1OO-I型托盘天平购自常熟市天量仪器有限责任公司；BCD-188K/ACJN型冰箱购自青岛海尔股份有限公司；RT-2100C酶标分析仪购自深圳市雷杜电子有限公司；MLS-3780型全自动高压灭菌器购自日本SANYO公司。

1.2 菌种来源 共4株菌株用于实验。其中，两株为临床上的产ESBLs大肠埃希菌(临床菌株1、临床菌株2)，由陕西中医药大学第一附属医院检验科提供，按照第4版《全国临床检验操作规程》[7]进行分离培养，使用法国梅里埃公司 VITEK®2 Compact 全自动微生物分析系统进行菌种鉴定。另两株大肠埃希菌标准菌株ATCC25922、ATCC35918购自温州市康泰生物科技有限公司，前者为β-内酰胺酶阴性的标准菌株，后者为产β-内酰胺酶大肠埃希菌的标准菌株(含质粒编码的TEM-1基因)。

1.3 实验步骤

1.3.1 药物预处理：将葛根、黄连、黄芩、甘草按复方比例5 ∶3 ∶3 ∶1混煎，使浓缩饮片复方的初始原浓度为2.21 g/mL(即每毫升含原药材2.21 g)，高压蒸汽灭菌备用。

1.3.2 制备细菌悬液：先将4株菌株接种于平板营养琼脂培养基内，放置于37℃培养箱中培养过夜，记号笔标记。挑选培养16～20 h后单个生长状态良好的大肠埃希菌菌落，接种于肉汤培养基中，放置于37℃恒温摇床上震摇4 h。在分光光度计上600 nm波长位置测细菌的A值，A值保持在0.01左右。

1.3.3 微量二倍稀释法测定最小抑菌浓度[8]：(1)稀释药液、加菌悬液。每株菌株均分为实验组(5个浓度)、纯药组、纯菌对照组、纯培养基对照组，在96孔板上进行实验。实验组用二倍法稀释药液，将药液浓度配置为原浓度以及原浓度的1/2、1/4、1/8、1/16，每孔加100 μL药液后，再加入100 μL菌液，每孔菌液最终浓度为105CFU/mL。纯药组每孔加药液100 μL和营养肉汤100 μL，纯菌组每孔加菌液100 μL和营养肉汤100 μL，纯培养基对照组每孔加营养肉汤200 μL，纯药组的浓度梯度和实验组一样。同时做3个平行组。(2) 测A值。将各组的96孔板放入酶标仪中，在600 nm波长下测每个孔的A值，记录测定时间及A值，然后放入37℃的摇床上培养，每隔3 h测定1次A值，共测量4次，取3个平行组的平均值。A值随着时间没有变化的药物最小浓度可以认定为最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)。(4)生长速度的计算：以时间作为横坐标，以A值作为纵坐标，绘制折线图，从每个折点图中计算出每个曲线的斜率，即细菌生长速度。将各浓度实验组与纯菌对照组的生长曲线斜率进行对比，斜率大于纯菌组时，说明该浓度的药物可以促进细菌生长，斜率小于纯菌组时说明该浓度的药物可以抑制细菌生长。

1.3.4 涂平板法测最低杀菌浓度：摇床上连续震摇测完A值后(共9 h)，各组在96孔板(即1～8孔)上，用移液枪分别吸取50 μL/孔移到固体培养基上，用玻璃刮铲涂抹均匀。将制作好的平板放入37℃的培养箱中，培养18 h后观察结果。平板上低于5个菌落，可认定此浓度为最小杀菌浓度(minimum bactericidal concentration,MBC)。实验重复3次取平均值。

2 结 果

2.1 葛根芩连汤对4株菌株的MIC及MBC 葛根芩连汤对临床菌株1和2的MIC都是原浓度的1/2，对标准菌株ATCC35918的MIC最小，对标准菌株ATCC25922的MIC最大，即葛根芩连汤对于标准菌株ATCC35918的抑菌效果大于对标准菌株ATCC25922；葛根芩连汤对临床菌株1和2的MBC分别是1/2原浓度和原浓度，而葛根芩连汤对两株标准菌株均无MBC，即原浓度的平板培养后菌落数大于5个。见表1。

表1 葛根芩连汤对4株大肠埃希菌的MIC和MBC(g/mL)

注：“无”指没有MBC；g/mL指每毫升含原药材克数。

2.2 葛根芩连汤对临床菌株及标准菌株生长速度的影响 原浓度至1/4原浓度的葛根芩连汤均可抑制产ESBLs的临床菌株1和2的生长速度。原浓度至1/16原浓度的葛根芩连汤对产β-内酰胺酶标准菌株ATCC35918的生长都具有抑制作用；1/2原浓度至1/16原浓度的葛根芩连汤对标准菌株ATCC25922的生长反而具有促进作用，其生长速度快于纯菌，即葛根芩连汤对两种标准菌株的作用截然相反。见表2。

表2 不同浓度葛根芩连汤干预下4种大肠埃希菌的生长速度

注：纯菌对照组中，临床菌株1、临床菌株2、标准菌株ATCC35918及ATCC25922的生长速度分别为0.0923、0.1282、0.1075、0.0945。

3 讨 论

20世纪80年代，国内多项体外抑菌实验结果表明，中药对肠道细菌的体外抑菌效果不如西药[9-10]。但其中大多数研究都是测定中药的MIC，这对本身抑菌作用并不太强的中药来说，意义并不大。然而，在临床上我们发现中药及中药复方都有比较强的抗感染作用，有学者认为，中药是通过调节人体的免疫系统来对抗病原微生物的感染[11]。近几年，有关中药针对细菌的直接作用研究较少，但随着对微生态的了解和实验方法技术的提高，中药是否可以通过对菌群的调节作用来对抗各种感染引起了研究人员的重视，尤其是针对抗生素滥用导致的菌群失调情况下耐药性细菌引起的机会感染。

葛根芩连汤单味药葛根、黄连、黄芩、甘草中的有效成分都有抑菌和抗炎作用[12-13]。复方葛根芩连汤在临床上被广泛应用于治疗腹泻和肠炎，甚至糖尿病的足部感染。本研究应用微量二倍稀释法和平板涂布法分别检测MIC和MBC，主要观察葛根芩连汤在体外对大肠埃希菌耐药菌株和非耐药菌株的抑菌作用是否有差异；同时，考虑到中药粗提物本身有颜色，所以在测A值时采用动态测定。结果显示，葛根芩连汤对产β-内酰胺酶大肠埃希菌(ATCC35918)的生长速度有明显的抑制作用，而对非耐药大肠埃希菌(ATCC25922)不仅没有抑制作用，还提高了细菌的生长速度。这表明，葛根芩连汤有调节肠道菌群的作用，尤其是针对长期应用抗生素后的耐药细菌的感染。为了进一步印证这个结论，我们观察了葛根芩连汤对来自临床的两株产ESBLs菌株体外生长速度的影响，发现药物浓度大的葛根芩连汤对两株产ESBLs菌株都有明显的抑制作用，说明葛根芩连汤可以通过调整肠道菌群的作用来治疗耐药菌感染。但当浓度变小时，葛根芩连汤对来自临床的两株产ESBLs菌株作用不明显，并且作用效果不尽相同：原浓度的1/8和1/16葛根芩连汤对临床菌株1的生长有促进作用，而对临床菌株2有抑制作用。由于来自临床产ESBLs菌株遗传背景并不清楚，而临床产ESBLs菌株的基因型有很多种，不同基因型的产ESBLs菌株对中药的敏感性也不尽相同。

葛根芩连汤对临床产ESBLs大肠埃希菌有较好的抑菌及杀菌作用，而对非耐药大肠埃希菌的抑制作用弱。因此葛根芩连汤或可通过调整应用抗生素后出现的产ESBLs大肠埃希菌和非耐药大肠埃希菌的菌群紊乱来治疗肠道感染。在今后的研究中可以对不同基因型的产ESBLs菌株进行分型，以及对葛根芩连汤的有效成分进行分离研究，以探索葛根芩连汤对ESBLs菌株的作用机制。