社区获得性肺炎并脓毒症患者Caspase-12基因多态性及表达的研究

卜宝英 顾鑫亮 宣鹏飞 武敏 徐喜媛 杨敬平

1内蒙古医科大学第三附属医院呼吸与危重症医学科,包头014010;2包钢三医院急诊科,包头014010

脓毒症是机体对感染产生的失调的免疫反应,导致多系统及器官功能障碍的综合征[1]。脓毒症病死率高,明确其病理生理学机制是降低病死率的关键[2-3]。脓毒症发病机制尚不明确,研究表明脓毒症导致的失调的免疫反应包括固有免疫和获得性免疫,与遗传及基因变异有密切关联[1,4]。研究表明80%的非洲人种存在Caspase-12 基因多态性,其中Caspase-12L等位基因可减少脂多糖诱导的细胞因子的产生[5-6]。Saleh 等[7]发现Caspase-12 作为显性负调节因子,可抑制了IL-1β、IL-18等产生。本研究通过检测脓毒症患者Caspase-12 基因多态性及Caspase-12表达,了解其在脓毒症发病中的作用。

1 对象与方法

1.1 研究对象 纳入2016年2月至2018年5月符合社区获得性肺炎,同时符合脓毒症诊断标准[1-2]入住内蒙古医科大学第三附属医院呼吸与危重症医学科的脓毒症患者共34例为脓毒症组,其中男20例,女14例;年龄(57.3±15.2)岁。选取内蒙古医科大学第三附属医院体检中心22名健康体检者为对照组,其中男13名,女9名;年龄(56.5±13.5)岁。排除标准：存在免疫抑制;前8周内接受过化疗;年龄＞80岁;肝肾功能衰竭患者。2组的年龄、性别比较,差异均无统计学意义(P值均＞0.05)。本研究通过内蒙古医科大学第三附属医院伦理委员会批准 (2015MER-024),受试者均签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 标本采集 抽取受试者入院第一天外周静脉血,-80 ℃冻存,批量检测。

1.2.2 外周血基因组DNA 提取 外周血基因组DNA 使用TransDirect TMAnimal Tissue PCR Kit(北京全式金生物技术有限公司)提取;全自动酶标仪(美国Thermo Fisher Scientific公司),检测DNA 浓度,选取浓度≥0.1 g/L,纯度1.7～1.9的DNA 为实验样品。

1.2.3 PCR 基因扩增采用PCR 仪 (美国ABI公司)进行,依据美国国家生物技术信息中心SNP 数 据 库 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/)查询基因序列,使用primer 5.0引物设计软件对Caspase-12的T125C 位点进行引物设计进行PCR 扩增,检测Caspase-12的T125C多 态 性。 引 物 序 列： 正 向 引 物 5'-GTCATTCTGTGTGTATTAATTGC-3';反向引物5'-CCTATAATATCATACATCTTGCTC-3'。使用TIANgel Midi Purification Kit[天根生化科技 (北京)有限公司,目录号DP209]纯化PCR 产物,在2.0%琼脂糖凝胶进行电泳 (100 V,50 A,30 min),以DNA MarkerⅠ为分子量标准,在紫外显色下观察、摄影。

1.2.4 基因测序 最终将纯化的PCR 产物提取20μl,并附T125C 正向引物、反向引物10μl由北京华大基因公司行基因测序。

1.2.5 荧光定量PCR 总RNA 提取后反转录总RNA,进行荧光定量PCR,用primer 5软件设计PCR 引物如下。

表1 Caspase-12荧光定量PCR 的引物序列

在荧光定量PCR 反应体系及反应条件下进行检测,用ΔCT 法计算结果,公式为：平均相对含量=未知样品的相对含量÷对照样品的相对含量=2-平均ΔcT。其中,ΔCT 未知样品=CT 未知样品-CT 内参。用SYBR GREEN I染料法对正常对照组及脓毒症组进行Caspase-12定量PCR 检测,以GAPDH、β-Actin cDNA 模 版 作 为 参 考,检 测Caspase-12的表达量。

1.2.5 蛋白质印迹法检测 首先新鲜抗凝血经洗涤后取得所需淋巴细胞后裂解,煮沸5 min使蛋白质变性。目的蛋白样品按照顺序在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶上点样,电泳结束后用PVDF 膜转膜,封闭、孵育一抗及二抗。PVDF膜在显色液中孵育,压片、曝光、显影并定影,扫描拍照。

1.3 统计学分析 采用SPSS 17.0软件包进行统计分析。定量资料以x-±s表示。采用正态分布参数的单因素方差分析和异常分布参数的秩和检验,对两组连续变量进行比较。采用最小显著性差异检验比较3组间的差异。此外,利用遗传频率检验对哈迪-温伯格平衡进行评价。使用χ2测试组进行分析基因型分布的差异。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 目的片段的扩增 从脓毒症患者提取外周血基因组DNA,再设计特异引物并进行PCR 反应后获得电泳图谱 (图1)。纯化后产物的大小在300 bp附近,与预期结果一致。

图1 Caspase-12基因的表达图谱

2.2 目的片段的基因测序 将纯化的PCR 产物进行测序,结果未见Caspase-12的T125C 位点的基因突变(图3～4)。

2.3 RT-PCR 检 测Caspase-12 m RNA 表 达 血Caspase-12 m RNA 对照组及脓毒症组分别为0.52±0.27及1.59±0.84,脓毒症组明显高于对照组(t=6.441,P＜0.000 1),见图5。

2.4 蛋白质印迹法检测Caspase-12前体蛋白的表达结果 脓毒症组及对照组的Caspase-12 前体蛋白灰度值分别为0.81±0.28、0.56±0.18,脓毒症组明显高于对照组 (t=4.62,P＜0.000 1),见图6。

图2 Caspase-12基因的表达纯化后电泳图谱

图3 Caspase-12的基因峰图

2.5 Caspase-12 m RNA 表达水平与Caspase-12前体蛋白表达的相关性及对脓毒症的预测价值 经Pearson相关分析,入院第一天外周血Caspase-12 m RNA 表达水平与Caspase-12前体蛋白表达呈正相关(r=0.70,P＜0.001),见图7。

入院第一天外周血Caspase-12 m RNA 与Caspase-12前体蛋白表达水平的曲线下面积分别为0.901和0.719,Caspase-12 m RNA 表达水平与Caspase-12前体蛋白表达对脓毒症的诊断有统计学意义 (P值均＜0.05)。其中,以Caspase-12 m RNA 表达水平0.907为截断点,诊断的敏感度78.0%、特异度89.9%;以0.578为截断点,诊断的敏感度65.2%,特异度70.4% (图8)。

3 讨论

脓毒症是呼吸与危重症医学面临的最为常见且需要紧急处理的临床问题。脓毒症起始阶段发生强烈的促炎反应,形成失控性过度炎症反应,以后出现抗炎或免疫抑制状态,导致感染播散,出现血流动力学异常及器官功能障碍[1-3]。目前,脓毒血症的发病率、病死率明显偏高,但尚无有效的特异性及靶向治疗及特异性预警方法[1-3]。脓毒症发病与多基因调控有关,许多与内毒素信号转导通路相关的受体存在基因多态性,与免疫系统对病原微生物的清除能力相关。脓毒症的特异基因变化,可能为特异性的生物标记及靶向治疗提供依据[4-6]。炎症细胞因子介导的脓毒症与Caspase家族介导的免疫细胞凋亡及免疫抑制相关,尤其对固有免疫反应的作用更为重要[5-8]。人类Caspase-12 位于染色体11q22.3,具有调节炎性细胞因子及炎症反应的作用[5-7],如Caspase-12L 具有减少促炎反应,增强抑制炎症反应的作用,导致感染持续及严重脓毒症的发生[5-6]。但Chen等[6]的研究发现非裔人群中,Caspase-12L等位基因的存在与社区获得性肺炎的易感性、病死率及严重性无关。Wang等[8]报道在西尼罗河病毒感染中,Caspase-12具有正向调节Ⅰ型干扰素的作用,表明其对免疫反应也有正向调节作用。本实验检测了脓毒症患者静脉血中Caspase-12 m RNA 及Caspase-12前体蛋白的表达,结果显示脓毒症患者外周血中Caspase-12 m RNA 及前体蛋白均高表达且Caspase-12 mRNA 表达水平与Caspase-12前体蛋白表达呈正相关(r=0.49,P＜0.001),表明Caspase-12 参与了脓毒症的发生、发展过程,与前述报道相似[5-8]。Caspase-12 的基因多态性在不同种族具有明显差异,对Caspase-12第125位氨基酸基因测序结果表明：160例亚洲人及187例高加索人均为T125纯合子;而776例非裔血统T125 纯合子比例为79.8%,T125/T125C杂合子比例18.6%[9]。本研究结果中,脓毒症患者Caspase-12基因测序结果未见T125C 位点的基因突变,本研究与非洲人种中携带Caspase-12L等位基因的频率有较大差别,与上述报道相似[5-6,9]。但本试验样本量有限,需进一步增加样本量进行验证。Caspase-12的基因多态性对脓毒症的不同作用可能与细菌感染的种类及性别相关[9-11]。Caspase-12对免疫反应的正向或反向调节有待于进一步研究。

图4 Caspase-12 (T125C)基因测序结果

图5 各组外周血Caspase-12 m RNA 的表达

图6 对照组和脓毒症组外周血样中Caspase-12前体蛋白表达

脓毒症早期预警对降低病死率有重要意义。本研究表明,入院第一天Caspase-12 m RNA 表达水平与Caspase-12 前体蛋白表达的曲线下面积为0.901和0.719,对脓毒症的诊断有显著意义(P＜0.001,P=0.002)。以Caspase-12 m RNA 表达水平0.907为截断点,诊断脓毒症的敏感度78.0%、特异度89.9%;前体Caspase-12蛋白以0.578为截断点,诊断脓毒症的敏感度65.2%,特异度70.4%。Caspase-12 m RNA 及前体蛋白可能成为潜在的预警指标,对脓毒症诊断、评估、治疗提供重要的生物学标记。

图7 入院第一天2 组外周血Caspase-12 m RNA 与Caspase-12前体蛋白表达的相关性

图8 Caspase-12 mRNA 及Caspase-12前体蛋白的受试者工作特征曲线

本研究未见脓毒症患者Caspase-12 基因T125C位点的基因突变,应该进一步扩大样本量,并研究其他种族,如蒙古族等的相应基因及不同位点的多态性,将有助于不同区域对脓毒症发病机制、诊断及治疗提供新思路。

利益冲突 所有作者均声明不存在利益冲突