广西人群LHCGR基因位点rs10495960和rs7579411分布差异性研究

阙嘉妤，庞晓霞，覃莉，李秀霞，施桂玲，王俊利

(1. 右江民族医学院附属医院生殖医学中心，广西 百色 533000；2. 右江民族医学院附属医院住培基地技能培训中心，广西 百色 533000)

人黄体生成素/人绒毛膜促性腺激素受体(LHCGR)基因属于G蛋白偶联受体家族，位于2号染色体的短臂上(2p21)，参与正常生殖过程的多个环节，主要在性腺上表达，包括女性卵巢卵泡膜细胞、颗粒细胞、黄体和间质细胞以及男性睾丸间质细胞和脂肪细胞，尤其在激素调节、性分化、Leydig细胞发育中起重要作用。有研究发现其与相关生殖疾病的发生发展密切相关[1]，。有研究表明，多囊卵巢综合征(PCOS)[2]、 Leydig细胞发育不全(LCH)[3]、家族性男性性早熟(FMPP)[4]等生殖疾病与LHCGR多态性有关。本研究通过分析LHCGR基因多态性rs10495960和rs7579411两位点的基因型和等位基因频率在广西地区人群中的分布，并与HapMap数据库公布的4类人群(北京人群、日本人群、欧洲人群、非洲人群)的LHCGR 基因多态性分型数据进行比较，探讨LHCGR基因多态性在不同地区人群中的分布差异，为深入研究LHCGR基因多态性与相关疾病的发病机制提供重要的遗传学理论依据和分子生物学基础。

1 资料和方法

1.1 研究对象 随机选取2018年5月—2019年5月到右江民族医学院附属医院生殖中心门诊就诊的健康体检者573例，其中男274例，女299例，平均年龄(37.86±12.41)岁。所有研究对象相互之间无亲缘关系，且都来自广西地区，排除心脑血管疾病、感染性疾病及肿瘤患者等。本研究已获得医院医学伦理委员会的批准。

1.2 方法

1.2.1 提取DNA 采集研究对象3 ml静脉血，用乙二胺四乙酸二钾( EDTAK2) 抗凝，样本DNA 提取根据北京天根生化科技有限公司 DNA 提取试剂盒说明书进行，基因组 DNA 备用保存于-20℃冰箱。

1.2.2 制备引物 PCR引物交由上海天昊生物科技有限公司设计合成。rs10495960位点的上游引物序列为：GCCGTTCCTCCCTAGGTGCTAA；下游引物序列为：CCCTGTTCTTCTCGGATCCTTTG；延伸引物为：TCTCTCGGGTCAATTCGTCCTTTTTGGTCTCTGATTCTATTCCCGATGG；rs7579411位点上游引物序列为：CTCCAGTCTCCCCCTTGCTAAAGA；下游引物序列为：TGAGATCTGAGAGAGTATGAGGGGTGAA；延伸引物序列为：TCTCTCG

GGTCAATTCGTCCTT、AGATCTGAGAGAGTATGAGGGGTGATCG。

1.2.3 基因测序 反应体系(10 μl)包含ddH2O 6 μl、纯化后多重PCR产物2 μl、连接缓冲液 1 μl、5’连接引物混合液(1 μM)0.4 μl，3’连接引物混合液(2 μM)0.4 μl、高温连接酶0.25 μl混匀。PCR反应条件为：94℃ 1 min，56℃ 4 min，38个循环，4℃保存备用。取0.5 μl稀释后的连接产物，与0.5 μl Liz500 SIZE STANDARD，9 μl Hi-Di 混匀，上ABI3730XL测序前95℃变性5 min，用GeneMapper 4.1分析测序结果。

1.3 统计学方法 采用SPSS 19.0软件对实验结果进行统计学分析。采用直接计数法计算广西人群LHCGR基因2个位点的基因型和等位基因，用Hardy-Weinberg定律检验研究对象是否有代表性。用χ2检验比较不同组间的分布差异，P<0.05为差异有统计意义。

2 结果

2.1 基因型检测 LHCGR基因rs10495960和rs7579411位点经 Hardy-Weinberg平衡检验，两位点基因型P值(分别为0.10和0.87 )均>0.05，达Hardy-Weinberg平衡，表明本研究具有群体代表性。 测序结果显示，在广西地区人群中，rs10495960位点基因型为GG、GA、AA，rs7579411 位点基因型为CC、CT、TT。见图1、图2。

图1 LHCGR基因rs10495960测序图

图2 LHCGR基因rs7579411测序图

2.2 LHCGR基因rs10495960和rs7579411多态性在广西地区人群中的分布 统计分析表明，广西地区人群中，LHCGR基因rs10495960和rs7579411位点分别以GA/CT基因型多见，其频率分别为46.07%和47.12%，以G和C等位基因分布频率最高，各占64.05%和62.65%。rs10495960位点各基因型和等位基因频率在男、女两组间分布差异均有统计学意义(P<0.05)；rs7579411位点各基因型和等位基因频率在男、女两组间分布差异均无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 广西地区人群LHCGR基因rs10495960(G/A)和rs7579411(C/T)基因型及等位基因频率分布

注：表内计数资料数据用[n(%)]表示。

2.3 LHCGR基因rs10495960和rs7579411位点多态性在不同地区种族人群间的比较 如表2所示，广西地区人群 rs10495960位点的基因型频率与HapMap-JPT、HapMap-CEU、HapMap-YRI 相比差异均有统计学意义(P<0.05)，与 HapMap-CHB相比，差异无统计学意义(P>0.05)；广西地区人群 rs10495960位点的等位基因频率与HapMap-CHB、HapMap-JPT、 HapMap-CEU、HapMap-YRI相比差异均有统计学意义(P<0.05)。

如表3所示，广西地区人群rs7579411位点的基因型频率与HapMap-JPT、HapMap-YRI相比差异均有统计学意义(P<0.05)，与 HapMap-CHB、HapMap-CEU相比，差异无统计学意(P>0.05)；rs7579411位点的等位基因频率与HapMap-JPT、HapMap-YRI相比差异均有统计学意义(P<0.05)，与 HapMap-CHB、HapMap-CEU相比，差异无统计学意义(P>0.05)。

表2 广西地区人群 rs10495960位点多态性分布频率与HapMap公布的其他人群比较

注：①广西人群：Guangxi，北京人群：HapMap-CHB，日本人群：HapMap-JPT，欧洲人群：HapMap-CEU，非洲人群：HapMap-YRI；②表内计数资料数据用[n(%)]表示。

表3 广西地区人群rs7579411位点多态性分布频率与HapMap公布的其他人群比较

注：①广西人群：Guangxi，北京人群：HapMap-CHB，日本人群：HapMap-JPT，欧洲人群：HapMap-CEU，非洲人群：HapMap-YRI；②表内计数资料数据用[n(%)]表示。

3讨论

多囊卵巢综合征(polysistic ovary syndrome，PCOS)是常见的妇科内分泌疾病之一，最新的流行病学调查显示，在我国妇女中，PCOS的患病率高达5.6%[5]。PCOS临床主要表现为月经稀发或闭经、无排卵性不孕、肥胖及高雄激素血症，PCOS患者发生2型糖尿病、代谢综合征、血脂异常、高血压及子宫内膜癌等疾病的风险增加，严重危害着广大女性的身心健康和生活质量。

LHCGR基因对激素的识别和结合起着重要作用，参与Leydig细胞发育、激素调节、性分化，在生殖内分泌疾病的诊断和治疗中具有重要意义。LHCGR基因在激素调节过程中是促排卵的关键，在PCOS患者的卵巢卵泡中被认为是过早表达的。有研究发现[6]，PCOS患者血浆中伴有LHCGR表达水平明显升高，且LHCGR的高表达与胰岛素抵抗相关。全基因组关联分析(GWAS)提示LHCGR基因与汉族 PCOS发病相关[7]，Mutharasan等[8]检测到欧洲血统妇女中PCOS 与LHCGR基因两个位点rs7562215、rs 10495960多态性的强烈关联。在瑞典和丹麦患者中[9]，LHCGR基因中的两个位点rs4597581和rs 4953617多态性与睾丸生殖细胞癌的风险有关。罗嘉莉等[10]用Meta分析发现LHCGR基因rs13405728多态性与PCOS的发生相关，但存在种族差异，在亚洲人种中rs13405728与PCOS的发病相关，在欧美人种中rs13405728与PCOS的发病无关联。LHCGR基因多态性位点rs13405728的TC+CC基因型与新疆地区PCOS有相关性，可能是新疆地区PCOS的2个易感基因位点[11]。PCOS易感基因位点LHCGR在基因rsl3405728位点单核苷酸多态性参与了肥胖型维族PCOS患者的发病[12]。失活LHCGR基因突变可能是46，XY原发闭经的常见原因[13]。Zielen AC等[14]发现在一个巴基斯坦家族中，LHCGR基因中的一个新的纯合子框架移位变异与原发性卵巢功能不全有关。Lu Xuefeng等[15]的研究结果支持LHCGR的缺陷破坏排卵，但对受精和胚胎发育没有影响。由此可见LHCGR基因多态性与生殖内分泌疾病的研究较成熟广泛，但目前未见报道LHCGR基因位点rs10495960和rs7579411 多态性在不同人群分布状况。

经本实验结果分析，广西地区人群中LHCGR基因rs10495960 位点以G/A基因型较为常见(46.07%)，等位基因以G 较为常见(64.05%)；rs7579411位点则以C/T 基因型为主(47.12%)，等位基因以C为主(62.65%)。其中rs10495960位点基因型频率及等位基因频率在男女中的分布差异均有统计学意义，提示广西地区人群中 rs10495960位点多态性分布频率与性别有关联，男女之间存在分布的差异。另外，rs10495960位点基因型频率、rs7579411位点基因型频率及两位点的等位基因频率与 HapMap-JPT、HapMap-YRI人群比较，分布差异均有统计学意义。这些结果表明，广西人群中存在 LHCGR基因 rs10495960和rs7579411位点的多态性，这些多态性与其他种族之间存在差异性。基因多态性可因自然选择、生活环境影响及种族不同等因素作用而存在很大差异，我们研究结果同样体现这个特性。基因多态性可影响蛋白的表达和功能的差异，使得不同种群或个体之间对某些疾病的发生发展存在不同的易感性，这也是疾病药物治疗存在个体间差异和耐药性的重要因素之一。因此，本研究有助于我们了解广西人群中LHCGR基因多态性的遗传背景，为今后深入研究PCOS与多态性关系提供数据支持。