提高间充质干细胞表面CXCR4 表达的实验研究*

李 蓉 ，路海苏 ，胡书群 ，吕兰欣 ，2

（1 徐州医科大学，江苏221002；2 徐州医科大学附属医院急救中心）

干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞[1]。干细胞在多种疾病中已获得研究和应用，如烧伤、骨创伤、骨肿瘤、血管再生及修复、神经再生及修复、角膜修复、肝脏、肺、心肌修复等[2-3]。间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）具有易分离、扩增以及体外操作简便等特点，在组织工程、细胞移植、基因治疗等领域的应用前景十分广阔[4]。MSCs 迁移至受损部位进行细胞替代，并分泌各种因子，帮助受损部位重建功能[5-6]。

多种趋化因子、生长因子及黏附分子对MSCs具有趋化作用，引导其向损伤区及其邻近组织迁移，即干细胞归巢[7]。干细胞的归巢率在组织损伤治疗中有着重要意义。基质细胞衍生因子-1α（SDF-1α）及其趋化因子受体-4（CXCR4）在MSCs 迁移中发挥重要作用[8-10]。研究发现，MSCs 表面存在趋化因子受体CXCR4 和 CX3CR1，损伤区域 SDF-1α 和 fractalkine等趋化因子表达增加，作用于移植细胞表面受体，引导其向缺血病灶迁移[11]。然而体外培养的MSCs 在传代过程中，其表面CXCR4 受体逐渐减少，导致MSCs移植后归巢效率低下，难以发挥应有作用[12-13]。因此，提高MSCs 体外培养过程中CXCR4 受体的表达效率在细胞治疗中至关重要。

1 材料与方法

1.1 材料 兔骨髓间充质干细胞（赛业生物）；人脐带间充质干细胞（顺昊生物）；胎牛血清（FBS）（BI）；CCK-8 试剂盒（VICMED）；兔源 CXCR4 一抗（Abcam）；Alex594-抗兔二抗（Life Technology）；细胞培养相关试剂（Hyclone）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养：将兔骨髓间充质干细胞（Rabbit-MSCs）与人脐带间充质干细胞（HUC-MSCs）用含有10%胎牛血清的 L-DMEM 重悬，于 37 ℃、5% CO2培养。24 h 后换液，弃未贴壁细胞，待细胞达80%～90%融合时，以0.25%胰蛋白酶消化后按1∶2 传代，达到基本融合后再次消化传代，进行体外扩增和富集。

1.2.2 MSCs 处理：（1）低氧培养：将生长旺盛的第3代细胞接种于10 cm 培养皿及24 孔板中，培养至70%～80%融合后，置于 37 ℃、3%O2、5%CO2、92%N2的饱和湿度孵育箱内培养24 h。以常氧培养作为对照，分别行免疫荧光染色及流式细胞仪检测表面CXCR4 表达情况。（2）SDF-1 预处理：采用不同浓度SDF-1（1 ng/mL，10 ng/mL，100 ng/mL）培养液培养MSCs，以正常条件培养的MSCs 为对照组。在24h 检测细胞活性，取高浓度组进行免疫荧光染色及流式细胞仪检测细胞表面CXCR4 的表达。

1.2.3 CCK-8 检测细胞活性：向96 孔板的待检测细胞加入10%CCK-8 溶液培养2 h，每组6 个复孔，将100 μL 培养液转移至新96 孔板，全波长酶标仪检测450 nm 处吸光值。

1.2.4 免疫荧光染色：将24 孔板各待测孔弃去培养液，PBS 洗涤；3% BSA（含 0.1%Triton-X100）封闭1 h；兔源 CXCR4 一抗（1∶200）4 ℃孵育过夜；PBS 洗涤 2 次，37 ℃孵育 Alex594-抗兔二抗 1 h；PBS 洗 2次后用DAPI 进行细胞核染色，荧光显微镜观察。

1.2.5 流式细胞仪检测：弃去细胞培养液后PBS 洗涤，0.25%胰酶消化，使细胞悬浮，移入离心管，1 000 r/min 离心 5 min；弃上清，用含 2%BSA 的 PBS 液制成浓度为106/mL 的单细胞悬液；加入PE-CXCR4 抗体，4℃孵育 40 min；PBS 洗涤 2 次，使用流式细胞仪检测。

1.3 统计学处理 使用SPSS12.0 统计学软件进行数据分析。计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA），两组间比较时采用 Student’s T-test。P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 MSCs 镜下观察兔骨髓 MSCs 与人脐带MSCs培养3 天后换液，弃未贴壁细胞，光镜下观察，可见细胞80%～90%融合，均匀贴壁，形态均一，呈生长旺盛的漩涡样、辐射状排列的单层细胞。人脐带MSCs形态较兔骨髓MSCs 更为细长，体积更大，符合两类细胞特征。见图1。

图1 MSCs 镜下观察

2.2 MSCs 培养活性测定CCK-8 检测 结果显示，不同浓度 SDF-1（1 ng/mL，10 ng/mL，100 ng/mL）预处理对Rabbit-MSCs 活性无影响（图2A），低氧处理24 h 对细胞活力亦无显著影响（图2B）；HUC-MSCs和Rabbit-MSCs 分别经高浓度SDF-1 及低氧预处理后的细胞活性与正常培养组比较，差异均无统计学意义（P＞0.05），见图3。说明上述预处理方法对MSCs 细胞活性无抑制作用。

图2 两种预处理培养后Rabbit-MSCs 细胞活性

图3 两种预处理培养后Rabbit-MSCs 和HUC-MSCs 细胞活性

2.3 流式细胞仪检测MSCs 表面CXCR4 表达 正常培养条件下兔骨髓MSCs 及人脐带MSCs 表面CXCR4 表达率很低，分别为0.81%和2.86%。经高浓度SDF-1（100 ng/mL）和低氧处理后，两种 MSCs 表面CXCR4 表达有所提高，其中低氧环境下CXCR4表达提高更明显，两种MSCs 表面CXCR4 表达率分别为正常培养的1.91 倍和2.3 倍。见图4。

图4 流式细胞仪检测MSCs 表面CXCR4 表达

2.4 CXCR4 免疫荧光染色 图5 为Rabbit-MSCs和HUC-MSCs 免疫荧光染色结果，A/A’为正常培养组，可见其表面红色荧光很少，说明CXCR4 表达率低；B/B’、C/C’为 SDF-1 高浓度处理组及低氧处理组，结果显示，红色荧光较正常培养组有明显增多，说明两种处理方法均可以提高MSCs 表面CXCR4表达。这一结果与流式细胞仪检测结果一致。

图5 CXCR4 免疫荧光染色

3 讨 论

在众多干细胞中，MSCs 由于取材方便、可自身来源、易于分离、体外扩增能力强、无免疫排斥反应、无伦理争议等优势而成为再生医学领域的优选种子细胞[14-15]。骨髓来源和脐带来源的MSCs 是两类研究和应用较为广泛的间充质干细胞，在脑外伤、脑卒中、神经损伤、组织工程中被深入研究[15-18]。文献报道，SDF-1 与 CXCR4 具有相互作用，MSCs 表达 CXCR4，并沿SDF-1 浓度梯度进行迁移[19]。然而，体内MSCs 虽能表达较高水平的CXCR4，但随着体外培养时间的延长，MSCs 表达CXCR4 逐渐降低，从而影响MSCs 回输至体内向病灶区域迁移的能力[13，20-21]。因此，在干细胞治疗研究中，提高体外培养过程中MSCs 表面CXCR4 的表达水平具有十分重要意义。

有研究表明，肿瘤坏死因子-α（TNF-α），白介素-6（IL-6）等可以诱导 MSCs 表面 CXCR4 表达，但同时会抑制MSCs 增殖，甚至引起MSCs 凋亡[22]。研究显示，CXCR4 基因修饰可促进MSCs 向SDF-1 的定向迁移，在SDF-1 浓度适宜的条件下，定向迁移能力较对照组提高近5 倍，表明基因修饰是一种有效提高MSCs 表面CXCR4 表达的方法[23]。但是目前基因修饰采用的慢病毒或腺病毒载体存在潜在风险，不宜大规模临床试验的开展。

本研究旨在通过对MSCs 进行低氧和SDF-1 处理，提高MSCs 表面CXCR4 的表达。结果显示，低氧和SDF-1 两种处理方法均未抑制MSCs 的活性，适用于体外MSCs 的培养和扩增。流式细胞仪和免疫荧光检测显示，低氧和SDF-1 处理后MSCs 表面CXCR4 表达水平均有提高，其中低氧处理对提高两种MSCs 表面CXCR4 表达的效果均明显优于SDF-1 处理。Liu 等[13]研究结果显示，人骨髓来源 MSCs 在3%O2环境培养2 h 后其表面CXCR4 的表达是正常培养的4 倍左右。上述结果均表明，低氧环境培养MSCs 可有效提高MSCs 靶向性迁移能力，有助于解决干细胞治疗中存在的细胞移植方式、细胞归巢、细胞定植数量少等瓶颈问题，同时，低氧处理不需要使用昂贵的生长因子，是一种安全、廉价的方法。但需要指出的是，与以往研究结果对比发现，低氧处理MSCs 表面表达CXCR4 的效率与基因修饰法的差距较大，因此需要进一步研究如何更有效提高低氧处理的效率。有研究表明，低氧诱导因子-1α（HIF-1α）可以提高 MSCs 表面 CXCR4 的表达[13]。HIF-1 是一种异源二聚体，主要由HIF-1α 和HIF-1β 两个亚单位组成。HIF-1β 在细胞内稳定表达，发挥结构性作用[24]。HIF-1α 是 HIF-1 的活性亚基，受缺氧信号的调控。推测在低氧条件下，细胞内的缺氧环境活化HIF-1α 亚基，从而使得细胞表面CXCR4 表达增高。因此，进一步研究HIF-1α 通过哪些信号通路影响CXCR4 的表达，可能有助于提高低氧处理促进CXCR4 表达的效率。

综上所述，本研究通过低氧预处理及SDF-1 预处理对两种来源的间充质干细胞进行培养，采用CCK-8 检测细胞活性，免疫荧光染色及流式细胞仪检测细胞表面CXCR4 表达情况，结果表明两种处理方法均不影响细胞活性，能提高细胞表面CXCR4 表达，其中低氧预处理的效果更为显著。提示低氧环境下进行MSCs 体外培养是提高CXCR4 表达的有效、廉价方法，有望在临床干细胞治疗中广泛应用。