壳聚糖-普鲁兰多糖复合抗菌保鲜膜对冷鲜牛肉的保鲜效果

张 盼 王俊平

（天津科技大学食品科学与工程学院 天津市食品加工过程控制与安全工程技术中心 天津300457）

可食膜是以可食性生物大分子为原料， 通过分子间的交联作用形成质地均匀， 具有一定机械强度的薄膜[1]。可食膜不仅具有传统包装所具有的阻隔性能， 而且可以作为营养强化物质和功能性物质的载体。将抑菌剂添加到可食性成膜材料中，抑菌剂会缓慢释放， 在较长时间内作用于食品表面，具备抑制微生物生长的作用[2]。

普鲁兰多糖是一种由霉菌发酵而成的微生物多糖，无色无味，具有良好的成膜性和热封性。 壳聚糖是由自然界广泛存在的几丁质通过脱乙酰作用得到，具有良好的成膜特性，一定的抗菌活性和抗氧化性，不溶于水，可溶于醋酸稀溶液[3]。 ε-PL是目前天然防腐剂中具有优良防腐性能的生物类食品防腐剂，安全性高[4]。 ε-PL 性质很稳定，在较低的pH 条件下依然保持良好的抑菌性。

本文利用普鲁兰多糖和壳聚糖作为成膜基质，充分发挥两者在成膜特性方面的互补作用，同时添加ε-PL 作为抑菌剂，制备具有抗菌效果的可食性包装膜并对该膜应用于冷鲜牛肉的保鲜效果进行研究。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 试验材料与菌株 主要试剂：壳聚糖（脱乙酰度90%），上海源叶生物科技有限公司；普鲁兰多糖，上海阿拉丁生化科技有限公司；ε-PL，上海源叶生物科技有限公司。

实验菌株：大肠杆菌（Escherichia coli）ATCC 10305 和ATCC 35150； 单增李斯特菌ATCC 19115（Listeria monocytogenes）；金黄色葡萄球菌ATCC 25923 （Staphyloccocus aureus）； 沙门氏菌CICC 10867（Salmonella enteritidis）；枯草芽孢杆菌CICC 10293（Bacillus subtilis）。 上述菌种均购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。

1.1.2 仪器与设备 SW-CJ-2FD 超净工作台，苏州净化设备有限公司；SP-2102 紫外-可见分光光度计， 上海光谱仪器有限公司；B-100AP 紫外灯（UVP），美国；BL610 分析天平，美国Sartorius 公司；TGL-16C 台式离心机， 上海安亭科学仪器厂；SY-1-2 电热恒温水浴锅，天津欧诺仪器仪表有限公司；DHP-2042BS 电热恒温培养箱，美国Thermo公司；RH-KT/C 磁力搅拌器， 德国IKA 公司；CH37M Milli-Q 超纯水系统，美国Millipore 公司；HVA-85 高压灭菌锅，日本hirayama 公司；HYGIIa 摇瓶柜， 太仓市实验设备厂；SU-1510 型扫描式电子显微镜，日本Hitachi 公司。

1.2 试验方法

1.2.1 ε-PL 最低抑菌浓度的确定 试验方法参照文献并稍作修改[5]，采用96 孔板二倍梯度稀释法，将ε-PL 梯度稀释质量浓度范围0.125～64 mg/mL，分别将测试菌金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌、枯草芽孢杆菌在37 ℃条件下摇床培养至测试菌浓106CFU/mL， 取100 μL 加入到96 孔板中，于37 ℃恒温培养箱中加盖培养24 h。 在OD=600 nm 条件下检测吸光度值， 确定ε-PL 的最佳添加量，ε-PL 的最佳添加量为抑菌率达90%时的量。

抑菌率=（OD 菌液-OD）/OD 菌液

1.2.2 可食性抗菌保鲜膜的制备 将壳聚糖溶于体积分数为1%的醋酸溶液， 加热至60 ℃，500～800 r/min 搅拌30 min， 加入普鲁兰多糖和上述试验结果中的最小抑菌浓度的ε-PL，1%的甘油，继续搅拌1～2 h。 按照上述方法分别配制壳聚糖-普鲁兰多糖比例为15-0，15-10，15-15，15-20，0-15，10-15 和20-15 g/L 的混合液 （所制备可食性包装膜分别标记为CP0，CP1，CP2，CP3，PC0，PC1和PC2）。然后静置12 h，达到自然脱气的效果，然后将30 mL 成膜基液浇铸于规格为15 cm×15 cm×1 cm 的亚克力材料模具， 室温干燥48 h， 小心揭起。

1.2.3 可食性抗菌保鲜膜机械强度测定 试验方法参照文献[6]， 将抗菌膜样品裁剪为2 cm×6 cm的矩形条状，在干燥器（相对湿度30%，温度25℃）平衡一天备用。 测试条件： 拉伸速度40 mm/min，初始长度30 mm，测试环境温度24 ℃，相对湿度56%。 抗拉强度（TS）和断裂伸长率（E）计算公式如下：

式中，F——断裂时的最大负荷，屈服负荷/N；S——可食性抗菌保鲜膜的横截面积/mm2；TS——拉伸强度/MPa。

L——可食性抗菌保鲜膜样品断裂时的长度/mm；L0——可食性抗菌保鲜膜样品的初始长度/mm。

1.2.4 可食性抗菌保鲜膜形貌特征 以A4 白纸为背景，分别对壳聚糖单一成分的抗菌膜、普鲁兰多糖单一成分的抗菌膜、壳聚糖-普鲁兰多糖抗菌复合膜拍照记录。

1.2.5 可食性抗菌保鲜膜微观结构测定 试验方法参照文献[7]将单一多糖成分的样品膜CP0、PC0和复合膜CP2 样品膜裁剪为5 mm×5 mm 大小，液氮速冻，断裂，选择完整的断面，用导电胶将其固定于铜台，真空镀金，选择加速电压5kV，观察并记录样品微观形态结构。

1.2.6 可食性抗菌保鲜膜抑菌性能的评价 用打孔器将复合抗菌膜（CP2，记作A）、壳聚糖膜（未添加ε-PL，记作B）、普鲁兰多糖膜（未添加ε-PL，记作C）裁剪为直径6 mm 的圆片放在干燥器中备用。将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、枯草芽孢杆菌分别在LB 液体培养基培养至OD=0.5（约1×108CFU/mL），取100 μL 加入到LB 固体培养基， 涂布均匀， 将制备好的3 种膜贴于平板表面，将培养基平板放置于37 ℃培养箱中，恒温培养24 h，观察抑菌圈的大小，并拍照记录。

1.2.7 可食性抗菌保鲜膜对牛肉的保鲜作用

1.2.7.1 对牛肉外观品质的保持效果 冷鲜牛肉样品购于乐购超市，4 ℃条件下运回实验室， 切成3 cm×3 cm，厚度约1 cm 小块，均分为两组，空白对照组和抗菌膜处理组，置于4 ℃条件下，分别在第1，3，5，7，9，11，13 天观察并拍照记录。

牛肉色泽测定参照文献[8]的方法，利用色差计对样品进行测定，采用a*/b*表示牛肉样品的红色指数，a*/b*值越大，表示色泽越鲜艳，品质越好。

1.2.7.2 贮藏期间pH 值的测定 参考GB/T 9695.5-2008 《肉与肉制品pH 值测定》的标准方法进行测定。

1.2.7.3 贮藏期间TVBN 的测定 参照文献[9]的方法采用康威扩散法进行测定。

1.2.7.4 牛肉表面菌落总数的测定 试验选择菌落总数为1×10-4CFU/g 的牛肉作为试验样品。 菌落总数测定参照GB/T 47889.2-2010《食品微生物学检验菌落总数测定》的方法进行测定。

1.2.7.5 牛肉表面优势致病菌的测定 样品处理：医用洁尔灭浸泡3 min，无菌去离子水冲洗，在无菌操作室用无菌刀片切成3cm×3cm， 厚度约1cm 小块，均分为两组，空白对照组和处理组。 每个接种样品进行双份接种，接种完毕后，其中一份进行实际接种数测定，另一份用作后续贮藏实验。

接种物准备：以肠出血性大肠O157：H7、沙门氏菌和单增李斯特菌为目标菌[10]，将3 株菌分别活化， 在10 mL LB 液体培养基中培养至浓度约105～106CFU/mL，接种量500 μL。 静置30 min，使菌液充分分散到肉的表面。

2 结果与讨论

2.1 最低抑菌浓度

试验结果表明ε-PL 对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、 沙门氏菌和枯草芽孢杆菌的最小抑菌质量浓度分别为1，4，2，0.5 mg/mL。其中革兰氏阳性菌较革兰氏阴性菌更敏感， 可能是因为革兰氏阴性菌的细胞膜结构有一定的阻水效果[11]。 因此本文确定ε-PL 在抗菌膜中添加量为4 mg/mL。

2.2 可食性复合抗菌保鲜膜的机械性能评价

由图1 可得壳聚糖膜CP0 抗拉强度TS（MPa）值为32.90，断裂伸长率为54.46，普鲁兰多糖膜（PC0）的TS（MPa）值为30.37，断裂伸长率为2.34。 可以得出壳聚糖膜的延展性能比较好，普鲁兰多糖膜比较脆。CP0、CP1、CP2 和CP3 的测试结果显示，壳聚糖含量不变时，随着普鲁兰多糖含量的增加，复合膜的抗拉强度逐渐增加，但配方CP2与CP3 的TS（MPa）值增加量没有显著差异。 复合膜断裂伸长率较壳聚糖膜明显减小， 而且随着普鲁兰多糖含量的增加，断裂伸长率有减小的趋势。综合考虑，选取CP2 作为成膜基质最佳配比。

2.3 可食性复合抗菌保鲜膜的形貌特征

试验结果如图2 所示， 可以看出单一成分的壳聚糖膜（CP0）颜色偏黄，且褶皱不平。 而单一成分普鲁兰多糖膜（PC0）透明度较高，但柔韧性不够好，较脆，且阻水性很差。复合膜（CP2）结合二者优点，既保持了良好的外观色泽，又有较佳的机械性能，达到了优势互补的效果。

图2 可食性抗菌保鲜膜的形貌特征Fig.2 Morphological features of antibacterial-film

图3 抗菌膜的扫描电镜图Fig.3 The SEM images of antibacterial-film

2.4 可食性复合抗菌保鲜膜的微观结构

图3 表明，单一成分的壳聚糖膜（CP0）的截面有轻微的凹凸不平和褶皱， 原因是壳聚糖大分子之间的氢键作用使得分子之间发生了团聚现象，整体有聚拢趋势。普鲁兰多糖膜（PC0）的表面和横切面都比较均一，无任何褶皱。从制备成膜液后也可以观察到壳聚糖膜液黏度很大，质地不均匀，而普鲁兰多糖膜液呈现无色均一透明状， 黏度比较小。 所以普鲁兰多糖膜质地均一。 复合抗菌膜（CP2）断面结构状态介于CP0 和PC0 之间，说明两种多糖的混合既能改善壳聚糖膜的聚拢效果，又能增强普鲁兰多糖膜的成膜效果。

2.5 可食性复合抗菌保鲜膜的抑菌效果

试验结果如图4， 单独的普鲁兰多糖膜没有抑菌圈，说明普鲁兰多糖没有抑菌性。壳聚糖本身有一定的抑菌性，所以壳聚糖膜有抑菌圈。普鲁兰多糖-壳聚糖多糖抗菌复合膜的抑菌圈最大，证明ε-PL 的抑菌性能在多糖交联矩阵中依然保持其良好的抑菌性能。 根据对4 种细菌的抑菌圈的大小范围，可以看出金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的抑菌圈范围比大肠杆菌和沙门氏菌大，ε-PL对革兰氏阳性菌的抑制作用比革兰氏阴性菌强。此结论与ε-PL 在液体培养基中的研究结果一致。

图4 多糖膜的抑菌实验结果Fig.4 The inhibition effect of films

2.6 可食性复合抗菌保鲜膜对牛肉外观品质的保持效果

在贮藏期间， 微生物和新陈代谢共同作用都会引起样品物理和化学的变化， 有腐败的气味产生， 肉的表面会有黏液附着， 颜色由红色变为棕色。色泽是消费者判断新鲜程度的一个重要指标，红色指数与肌红蛋白含量有关， 贮藏过程中肌红蛋白被氧化为高铁肌红蛋白，肉色加深[12]。 试验结果如图5，对照组在第7 天时颜色显著加深，第11天彻底变为黑褐色，汁液流失，腐败变质。 而处理组到第13 天仍然保持良好的感官状态。

由图6 可得， 在贮藏期间两组红色指数均呈现下降趋势，在第9 天后，红色指数急剧下降，与上述外观品质变化结果一致。 处理组的红色指数始终高于对照组， 说明可食性复合抗菌保鲜膜有抗氧化作用，能够使牛肉保持良好的色泽。

图5 壳聚糖-普鲁兰多糖复合抗菌保鲜膜处理后牛肉外观Fig.5 Beef appearance after chitosan-pullulan antibacterial-films treatment

图6 壳聚糖-普鲁兰多糖复合抗菌保鲜膜对牛肉色泽的影响Fig.6 Effect of chitosan-pullulan antibacterial-films on beef redness index

图7 壳聚糖-普鲁兰多糖复合抗菌保鲜膜对贮藏期间牛肉pH 值的影响Fig.7 Effect of chitosan-pullulan antibacterial-films on pH of beef during storage

2.7 贮藏期间牛肉pH 的变化

随着贮藏时间的延长， 对照组的pH 逐渐增大，第5 天时增长较快，可能原因是牛肉内源蛋白酶与腐败菌共同作用，加速蛋白质分解，释放胺类和三甲胺等碱性物质[13]。处理组的pH 在第3 天至第5 天有下降趋势， 其原因与乳酸菌引起腐败产生的乳酸和ATP 产生的代谢产物有关[14]。 贮藏期间处理组使牛肉的pH 维持在5.77～6.13， 说明该可食性复合抗菌保鲜膜有效地抑制了腐败微生物的生长和内源蛋白酶的活性[15]。

2.8 可食性复合抗菌保鲜膜对贮藏期间牛肉TVBN 的抑制效果

图8 壳聚糖-普鲁兰多糖抗菌保鲜膜对贮藏期间牛肉TVBN 的影响Fig.8 Effect of chitosan-pullulan antibacterial-films on TVBN of beef during storage

挥发性盐基氮是衡量腐败程度的重要指标。原因包括，内源性酶和微生物作用。GB/T 9959.2-2008 按照肉的新鲜程度划分为3 个等级：牛肉的TVBN<15 mg/100 g 符合国家一级鲜度标准；15 mg/100g≤TVBN≤20 mg/100 g 为二级鲜度标准；TVBN＞20 mg/100 g 时为腐败肉。 试验结果（图8）表明，牛肉TVBN 初始值为8.78 mg/100 g，品质良好。 1～5 d 对照组和处理组的TVBN 值缓慢增长，第5 天时处理组为15.35 mg/100 g， 为二级鲜度。第7 天远超腐败标准， 而对照组在第9 天时达上限。说明ε-PL 和壳聚糖有效地抑制了牛肉腐败进程，延缓了肉的腐败变质。

2.9 可食性复合抗菌保鲜膜对贮藏期间牛肉表面菌落总数和致病菌的抑制作用

细菌的大量繁殖不仅导致食品腐败变质，还会产生毒素等有害物质，威胁人类健康，所以检测菌落总数也是评价冷鲜肉质量与安全的指标。 图9a 显示，菌落总数初始值4 lg（CFU/g），随着贮藏时间的延长，对照组菌落总数一直在持续上升，处理组则呈现前期下降后期上升趋势。 第9 天超过了4 lg（CFU/g）。

大肠杆菌是常见食源性菌群， 其中大肠杆菌O157：H7 可以诱发血型肠炎、腹泻等病症。沙门氏菌也是常见人畜共患病原菌， 也已诱发多起国内细菌性食物中毒[16]。单增李斯特菌在4 ℃条件下仍可大量繁殖，是典型的嗜冷菌，同时也是牛肉、羊肉等红肉中优势致病菌[17]。 可食性复合抗菌保鲜膜对3 种致病菌的抑制作用效果分别如图9b、图9c 和图9d。 贮藏期间，单增李斯特菌增长速度高于大肠杆菌O157：H7 和沙门氏菌。 可能是因为单增李斯特菌可以在较低的温度生存。 可食性抗菌保鲜膜对3 种潜在致病菌均有显著的抑制作用。贮藏末期，处理组大肠O157：H7，单增李斯特菌和沙门氏菌较对照组减少量分别为5.12，4.47和5.54 lg（CFU/cm2）。 说明可食性复合抗菌保鲜膜在前期对细菌的生长产生了一定的抑制效应，随着贮藏时间的延长，抑制效果逐渐减弱，其它几种优势致病菌的试验结果也表现出了相同趋势，说明该可食性复合抗菌保鲜膜起到了明显的抑菌效果，提高牛肉的食用安全水平。

图9 壳聚糖-普鲁兰多糖复合抗菌保鲜膜对贮藏期间牛肉的抑菌作用Fig.9 The inhibition effect of chitosan-pullulan antibacterial-films on beef during storage

3 结论

添加ε-PL 的壳聚糖-普鲁兰多糖可食性复合抗菌保鲜膜有良好的机械性能和抑菌性能。 将抗菌膜应用于牛肉贮藏保鲜， 能够有效的延缓其腐败速度，抑制微生物的生长，保持其良好的外观品质，延长货架期。该可食性复合抗菌保鲜膜原材料均安全可降解，具有广泛的应用前景。