酶解青花椒籽仁谷蛋白的乳液稳定性研究

瞿 瑗 侯晓艳 黎杉珊 申光辉 罗擎英 吴贺君 蒲 彪 叶 萌 张志清*

（1 四川农业大学食品学院 四川雅安625014 2 四川农业大学林学院 四川温江611130）

乳液体系在食品、化妆品和药品中很常见。就食品而言，乳液通常以水包油（O/W）的形式存在，如：酸奶、饮料、蛋黄酱等。由于乳液是由两种以上不相容的体系构成，所以是热力学不稳定体系，通常易发生絮凝、聚结和分层[1-2]。一般可以通过添加乳化剂来提高乳液稳定性， 常见的乳化剂有蛋白质、多糖、磷脂、小分子表面活性剂。

蛋白质是表面活性化合物，可以吸附在油-水界面，通过降低液滴表面张力来稳定乳液[3]。 蛋白质界面膜还可以通过产生排斥力和/或通过在液滴之间形成一个物理屏障来防止液滴发生聚集[3-4]。在大多数情况下选择蛋白质作为乳化剂[5]，是因为它们还可以作为增稠剂， 通过增加黏度或改变黏弹性来减少液滴的移动。 因大豆蛋白较好的适用性、 低成本和良好的功能特性而广泛应用于食品工业中， 已有许多利用大豆蛋白作为乳化剂的研究[6]。 然而，有的人因豆腥味、过敏、拒绝食用经遗传修饰的大豆或其它的饮食限制， 故不能接受含有大豆蛋白的食物。开发一种新型、价格低廉的蛋白质来替代大豆蛋白也是一种选择。

花椒籽是花椒生产中的主要副产物， 研究表明，脱壳后的花椒籽仁中蛋白质含量丰富[7]，通过进一步分析其组成成分和氨基酸组成， 评定其为一种较优质的蛋白质[8]。 此外，花椒籽仁蛋白已被证明具有充当乳化剂的潜力[8-9]。 花椒籽仁谷蛋白是花椒籽仁蛋白的主要成分， 其功能性质往往受到环境因素的影响， 使得花椒籽仁蛋白的应用受到极大限制， 然而应用改性技术可以提高花椒籽仁谷蛋白的功能性质。酶法改性因条件温和，产生的副产物少，故比其它改性方法好。 一般来说，酶法改性蛋白受蛋白质水解度、 酶的特异性以及每种底物固有特性的影响[10]。 其中，过度水解会产生大量的游离氨基酸和短肽链， 降低蛋白质的乳化性， 而有限的水解可使疏水性和亲水性残基暴露出来，增强蛋白质的两亲性，改善乳化特性[10]。 目前， 尚未见以酶水解花椒籽仁谷蛋白获得的蛋白水解产物作为乳化剂的研究。 本文研究了pH 值、离子强度、 温度对胰蛋白酶酶解青花椒籽仁谷蛋白乳液物理稳定性的影响， 比较不同水解度花椒籽仁谷蛋白乳液的物理稳定性， 分析使用胰蛋白酶酶解花椒籽仁谷蛋白得到的产物形成稳定乳液的能力， 为花椒籽仁谷蛋白作为乳化剂应用于食品工业中提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂 青花椒籽 （Zanthoxylum armatum DC.），采自四川省金阳县青花椒产地；胰蛋白酶（酶活力>2.5×105U/g），上海瑞永生物科技有限公司； NaCl、NaOH、HCl 等，均为分析纯，科龙化工试剂厂。

1.1.2 主要设备与仪器 FW-100 高速万能粉碎机， 北京中兴伟业仪器有限公司；SCIENTZ-12N冷冻干燥机， 宁波新芝生物科技股份有限公司；Thermo BR4i 离心机， 美国THERMO 公司；DK-8D 三孔电热恒温水槽， 上海齐欣科学有限公司；PHS-3C 酸度计， 上海佑科仪器仪表有限公司；DHG-9101 A 电热恒温干燥箱， 上海三发科学仪器有限公司； JHQ-Q54-P70 高压均质机，郑州玉祥食品机械有限公司；FJ-200-SH 型数显高速分散均质机， 上海右一仪器有限公司；Sartorius CP225D 电子天平， 德国SARTORIUS 公司；Rise系列-2006 型激光粒度分析仪， 济南润之科技有限公司；哈克MARS III 流变仪，美国Thermo-Scientific 公司。

1.2 试验方法

1.2.1 测试样品制备

1.2.1.1 青花椒籽仁谷蛋白制备 参考Dash 等[11]的方法并适当修改。 称取10 g 的脱脂青花椒籽仁，加入10 倍的蒸馏水，搅拌30 min，然后以8 000 r/min 离心20 min，离心去除上清液；接着向离心管里加入10 倍2% NaCl 溶液， 重复以上操作，去除上清液；再次向离心管里加入10 倍70%乙醇溶液，重复以上操作，去除上清液；最后向离心管里加入10 倍0.5% NaOH 溶液， 重复以上操作，收集上清液，提取谷蛋白，将上清液于室温下调节pH 至3.3，4 000 r/min 离心20 min 后， 取沉淀物于4 ℃透析48 h。 最终取沉淀物冷冻干燥备用。 花椒籽仁谷蛋白纯度达96.25%（干基，N%×6.25）。

1.2.1.2 不同水解度青花椒籽仁谷蛋白制备 参考Elavarasan 等[12]的方法并适当修改。 取1 g 花椒籽仁谷蛋白，按料液比1 ∶20 加入蒸馏水，于室温下水化 1 h。 调节pH=8， 置于50 ℃下保持15 min 后按酶底比为1∶50 添加胰蛋白酶进行水解。酶解完毕后于95 ℃加热5 min 使酶失活，迅速冰浴冷却至室温， 离心取上清液后冻干备用。 采用pH-stat 法[13]测定水解度。 本研究根据预试验结果选取水解时间分别为0.5，22，146 min 即水解度DH 依次为3%，6%和8%的酶解产物作后续研究（分别表示为DH3 ZADSKG、DH6 ZADSKG、DH8 ZADSKG）。

1.2.1.3 乳液制备 参考Tan 等[14]的方法并适当修改。 将蛋白质样品分散到10 mmol/L 磷酸盐缓冲液（pH 7.0）中并搅拌2 h 以确保完全水化。 采用高速分散均质机将10 mL 玉米油与90 mL 蛋白溶液（5 mg/mL）预混匀来制备粗乳剂，12 000 r/min搅拌2 min，然后使用高压均质机，在30 MPa 下高压均质3 次。 然后将质量浓度为0.2 mg/mL 的叠氮化钠加入到乳剂中以防止微生物生长。

1.2.2 乳液稳定性影响因素分析

1.2.2.1 不同水解度青花椒籽仁谷蛋白乳液储藏稳定性 分别取不同水解度的蛋白乳液10 mL于玻璃瓶中，置于25 ℃下储藏7 d。测定样品平均粒径变化，观察其乳析现象。

1.2.2.2 pH 对不同水解度青花椒籽仁谷蛋白乳液稳定性的影响 将不同水解度的蛋白乳液用0.5 mol/L HCl 或0.5 mol/L NaOH 调节pH 为3～9，室温下放置1 d 后测定样品的粒径大小，观察其乳析现象。

1.2.2.3 离子强度对不同水解度青花椒籽仁谷蛋白乳液稳定性的影响 分别添加不同浓度的Na-Cl（0，50，100，200，300 mmol/L）于样品中，室温下放置1 d 后测定样品的粒径大小， 观察其乳析现象。

1.2.2.4 热处理对不同水解度青花椒籽仁谷蛋白乳液稳定性的影响 将10 mL 新鲜制备的乳液置于玻璃瓶中。 分别于30，50，70，90 ℃下水浴30 min 后迅速冷却。 室温下放置1 d 后测定样品的粒径大小，观察其乳析现象。

1.2.3 指标测定

1.2.3.1 流变性测定 根据赵强忠等[15]的方法，采用流变仪进行测定。将250 μL 左右蛋白乳液置于夹具底部，所用转子为C35/1°Til，设置板间距为0.052 mm，持续时间为13.26 min，测定温度为25℃，测定剪切速率（5～100 s-1）随剪切应力的变化。根据power-law 模型对黏度系数K 和流动特性指数n 进行拟合。

τ=Kγn

式中：τ——剪切应力（mPa）；K——黏度系数（mPa·sn）；γ——剪切速率 （s-1）；n——流动性指数。

1.2.3.2 乳液平均粒径的测定 采用Rise 系列-2006 型激光粒度分析仪对乳液的平均粒径进行测定[16]。 样品用相同pH 及离子强度的缓冲液稀释100 倍以消除光散射效应，在25 ℃条件下进行测定。

1.3 数据统计处理

每次试验重复3 次，最终数据以平均值±标准偏差表示， 采用SPASS20.0 进行Tukey 检验分析样品之间的显著性差异，P＜0.05 表示具有显著性差异。

2 结果与分析

2.1 不同水解度青花椒籽仁谷蛋白乳液储藏稳定性

不同水解度花椒籽仁谷蛋白乳液储藏稳定性如图1 所示。 从图1b 可以看出，从1 d 开始，3 种水解度蛋白乳液均出现明显的分层，2 d 前下层较浑浊，从3 d 开始下层较透明。 从图1a 可以看出，新鲜蛋白乳液平均粒径随着水解度的增加而增大，DH3、DH6、DH8 的平均粒径依次为1.55，1.64，1.75 μm。 这表明在均质过程中水解度较低的蛋白质更易吸附到液滴表面， 更有效地抑制液滴聚结[17]。 随着储藏时间的延长，不同水解度蛋白乳液的平均粒径均增大。 储藏7 d 以后，DH3 的平均粒径增加到3.27 μm，DH6 增加到2.72 μm，DH8 增加到3.50 μm。由此可见，在储藏过程中，不同水解度花椒籽仁谷蛋白乳液在抑制液滴聚集的能力有显著不同， 水解度最佳的蛋白乳液在储藏期间可以更好地抑制液滴聚集。 这与Thaiphanit 等[18]和Mokni 等[19]的研究结果一致。 Thaiphanit 等[18]研究表明，水解度为8.25%～10.17%的椰子蛋白比水解度为11.04%～14.22%的能形成更稳定的乳液。Mokni 等[19]指出DH4%的鹰嘴豆分离蛋白乳化性最高， 而进一步水解导致蛋白分子结构破坏从而降低了乳化性。因此，本研究中可能是由于过度水解使DH8 花椒籽仁谷蛋白结构破坏，使其不能在乳状液的制备过程中提供维持空间结构稳定的作用力， 也不能在乳液液滴界面间形成强有力的界面膜，从而导致乳液稳定性较差。 另外，不同水解度蛋白乳液的液滴平均粒径随着储藏时间的增加，液滴絮凝导致粒径增加，这与2.5 节中的流变性实验样品黏度增加的结果一致。

图1 不同储藏时间对花椒籽仁谷蛋白乳液平均粒径（a）和表观特性变化（b）的影响Fig.1 Influence of storage time on the characteristics of oil-in-water ZADSKGH emulsions （a）mean particle size and （b）visual appearance of emulsions

2.2 不同水解度青花椒籽仁谷蛋白乳液的pH稳定性

pH 对不同水解度花椒籽仁谷蛋白乳液平均粒径及放置1 d 后表观特性的影响如图2 所示。从图2a 可以看出，3 种乳液平均粒径在pH 3～4之间均显著增大，在pH 6～9 之间变化较小；DH6的平均粒径在pH 3～9 范围内， 都低于DH3 和DH8 的乳液。 从图2b 也可以看到，3 种乳液在pH 3～4 之间出现明显分层， 上层为白色乳析层，下层为透明乳清层，其中DH6 的乳液较其它两种下层乳清层更透明； 在 pH 6～9 之间，DH3 和DH8 的乳液也有分层，下层较浑浊，而DH6 乳液保持稳定。 在低pH 下，乳液不稳定易于分层，此时乳液pH 接近花椒籽仁蛋白质等电点（PI=3.3），蛋白质净电荷的缺失导致乳滴间缺乏静电斥力而发生絮凝和聚结[20]，使得乳液粒径变大，进而加快了乳析速率[2]。Bucˇko 等[21]研究表明，南瓜种籽分离蛋白乳液在接近等电点处乳液极不稳定而发生聚集。 Ventureira 等[17]指出，DH 1.7%和DH 9.5%的苋菜蛋白乳液在pH 值接近等电点时， 乳液粒径最大，乳液不稳定发生絮凝和聚集，但是DH 1.7%的乳液在pH 2 和pH 8 水平上较DH 9.5%表现出更好的稳定性。

图2 pH 对不同水解度花椒籽仁谷蛋白乳液平均粒径（a）和放置1d 后表观特性（b）的影响Fig.2 Influence of pH value on the characteristics of oil-in-water ZADSKGH emulsions （a）mean particle size and （b）visual appearance of emulsions after 1 d storage

2.3 不同水解度青花椒籽仁谷蛋白乳液离子强度稳定性

离子强度对不同水解度花椒籽仁谷蛋白乳液的粒径及放置1 d 后表观特性的影响如图3 所示。 从图3a 可以看出，随着离子强度的增加，3 种水解度的花椒籽仁谷蛋白乳液平均粒径呈增加趋势。 图3b 与平均粒径变化结果一致，所有乳液因添加盐而不稳定，出现明显的分层，盐离子的加入使乳液失稳主要是由于其屏蔽了负电液滴之间的静电斥力所导致的[22]。DH3 的乳液在NaCl 浓度为200 mmol/L 时出现明显的色泽变化， 而DH6 和DH8 的乳液在NaCl 浓度为300 mmol/L 时才发生明显的色泽变化， 该现象是由于水解程度不同使得蛋白质亲电基团的暴露程度不一样所导致的。当水解度为3%时，蛋白质水解不完全，亲电基团较少的暴露出来。 而水解度为6%时，蛋白质水解完全，使得其亲电基团完全暴露，所以对NaCl 的耐受能力提高。 当水解度为8%时，蛋白质水解过度，肽链发生聚集，使得亲电基团包埋起来，整体暴露程度较DH3 的低， 所以对NaCl 的耐受力较DH3 的低。 当NaCl 浓度增加到300 mmol/L 时，DH8 的花椒籽仁谷蛋白乳液的平均粒径微微增大，DH6 的平均粒径显著增大，但是水解度为6%的乳液平均粒径随NaCl 浓度（0～500 mmol/L）的增加变化最小（从2.06 μm 增加到3.18 μm）。

图3 NaCl 对不同水解度花椒籽仁谷蛋白乳液平均粒径（a）和放置1 d 后表观特性（b）的影响Fig.3 Influence of NaCl on the characteristics of oil-in-water ZADSKGH emulsions （a）mean particle size and（b）visual appearance of emulsions after 1 d storage

2.4 不同水解度青花椒籽仁谷蛋白乳液热稳定性

图4 温度对不同水解度花椒籽仁谷蛋白乳液平均粒径（a）和放置1 d 后表观特性（b）的影响Fig.4 Influence of temperature on the characteristics of oil-in-water ZADSKGH emulsions （a）mean particle size and （b）visual appearance of emulsions after 1 d storage

不同温度处理对不同水解度花椒籽仁谷蛋白乳液稳定性的影响如图4 所示。 从图4a 可以看出，随着温度的增加，3 个水解度花椒籽仁谷蛋白乳液平均粒径随着温度的增加呈显著增加趋势，水解度为6%的花椒籽仁谷蛋白乳液平均粒径变化最小（2.19 μm 增加到2.82 μm）。 图4b 与平均粒径变化结果一致，从图中可以看出，经过较低温度（30、50 ℃）处理后，水解度为6%的花椒籽仁谷蛋白乳液较稳定， 水解度为3%和8%的乳液出现了分层，上层为乳析层，下层为乳清层，但经相对较高的温度（70，90 ℃）处理后的3 种乳液均出现了明显的分层， 水解度为3%和8%的乳清层颜色较6%的深。 这是因为加热使得蛋白质分子展开，将其疏水基团暴露于周围的水相中， 这大大增加了液滴之间的表面疏水性， 通过疏水作用促进液滴聚集[23]。 当蛋白质被加热到其变性温度后，巯基被暴露出来， 通过二硫键促进液滴之间发生聚集[24]。 在加热过程中，分子热运动会更剧烈，这将导致乳液液滴之间的碰撞频率更高， 乳滴进而易于聚结。 Singh 等[25]研究表明，高度水解的乳清蛋白形成的乳液经120 ℃处理后稳定性极差。 但是，由于水解度不同经较低温度（30、50 ℃）处理后，乳液的稳定性会产生两种不同的结果。 DH6%的乳液经较低温度（30，50 ℃）处理后具有比DH3%更高的稳定性。 可能的原因是：（1）花椒籽仁谷蛋白本来的球状结构已被破坏， 从而降低它们变性和聚集的能力，进而使其热稳定性提高；（2）加热使得蛋白质分子展开， 将其疏水基团暴露于周围的水相中，增加吸附的可能性，而亲水基团不可能发生聚集， 所以使得热稳定性增加。 当水解度达到8%时，蛋白质过度水解使其乳化性降低，在液滴表面易发生聚集，所以经较低温度（30，50 ℃）处理后，DH8%乳液也出现了明显的分层。

2.5 不同水解度花椒籽仁谷蛋白乳液流变性差异

不同水解度花椒籽仁谷蛋白乳液的稠度系数以及流动性指数结果如表1 所示， 显示了不同水解度花椒籽仁谷蛋白乳液的流变性差异。 目前已建立了多种模型来描述蛋白的流变特性， 幂律模型是最常使用的模型之一[26]。 流动曲线通过power-law 模型进行拟合， 并计算稠度系数和流动特性指数。 从表中可以看出，3 种水解度乳液的流动性指数n 均小于1，所以其为剪切变稀流体。 这与Thaiphanit 等[18]的研究结果一致，碱性蛋白酶酶解椰子蛋白得到不同水解度产物（8.25%～14.22%），以其制备的蛋白乳液都表现出剪切变稀行为。 随着剪切速率的增大，表观黏度不断降低，这是由于流体团簇或聚集体的变形、 破坏以及它们在流场内的排序导致的[2]。经过7d 的贮存，DH6 花椒籽仁谷蛋白乳液的稠度系数K 未发生明显变化，DH3和DH8 的花椒籽仁谷蛋白乳液在贮存期间稠度系数K 显著增加，流动特性指数n 显著降低，表明乳液在贮存7d 后发生了剪切变稀行为，乳液中发生了液滴絮凝现象， 进一步验证了储藏期间乳液平均粒径的变化。

表1 不同水解度花椒籽仁谷蛋白乳液稠度系数（K）以及流动性指数（n）变化Table 1 The consistency coefficient （K）and flow behaviour index （n）of oil-in-water ZADSKGH emulsions

3 结论

本文研究了pH、温度、离子强度对不同水解度青花椒籽仁谷蛋白乳液稳定性的影响。 结果表明，蛋白水解度显著影响其形成稳定乳液的能力，不同青花椒籽仁谷蛋白乳液的贮藏稳定性均较差， 在pH 3～9 下的平均粒径相似， 在等电点附件、高离子浓度下非常不稳定。 水解度为6%的花椒籽仁谷蛋白乳液对盐离子浓度和热处理有较强抵抗力。 本文结果表明水解后的花椒籽仁谷蛋白可以作为天然乳化剂形成稳定乳液。但是，应对复杂的环境条件， 未来还需要进一步的研究来提高乳液稳定性。