生物发酵脱腥海带的挥发性风味物质分析

王红丽 梁璋成 何志刚* 林晓姿 林向阳 陈 慎

（1 福建省农业科学院农业工程技术研究所 福州350003 2 福州大学生物科学与工程学院 福州350180 3 福建省农产品（食品）加工重点实验室 福州350003）

海带（Laminaria japonica）是一种兼具食用和药用的经济海藻，富含丰富的蛋白质、碳水化合物及粗纤维[1-3]，不但可以为人们活动提供所需要的能量，而且其中的多糖、粗纤维还能促进人们肠胃的蠕动，缓解便秘[4]。未经脱醒的海带，会对市场消费产生影响。 去除海带的腥味是其深加工的关键技术问题。

目前，对于研究海带脱腥方法的报道有很多[5]，但主要的脱腥方法有3 种， 即物理脱腥、 化学脱腥、生物脱腥[6]。 陈婉珠[7]利用酸法、醇法、甘草、β-环糊精掩蔽法、热水烫煮法等对海带脱腥，认为热水烫煮法脱腥效果最好。肖欣欣等[8]认为采用绿茶与甘草按照质量比4∶2 混合后对海带脱腥效果好。段吴勇[9]采用酿酒酵母和嗜热链球菌复合发酵脱腥，研究表明海带的腥味基本消失，具有淡淡的清香味。比较3 种方法脱腥技术，以物理脱腥效果较差，化学脱腥存在安全与污染问题，生物脱腥不仅可实现海带的脱腥、改善风味，且可提高营养。生物脱腥技术中，在鱼类、贝类脱除腥味成分方面的文献报道比较多[10-12]，而海带脱腥方面的研究报道大多限于脱腥工艺研究， 对海带脱除腥味成分方面的文献报道鲜少。 常用于生物脱腥的菌种有酵母菌、乳酸菌、醋酸杆菌等，但不同微生物发酵脱腥的效果及产生的风味存在差异。 本试验选用本实验室自行分离并保藏的副干酪乳杆菌副干酪亚种R37 和酿酒酵母J4 对海带进行脱腥， 采用HS-SPME-GC-MS 测定法， 结合感观评价分析海带经副干酪乳杆菌副干酪亚种R37 和酿酒酵母J4 发酵脱腥前后的挥发性风味物质与特征挥发性风味物质，探讨海带微生物脱腥机制，为海带生物脱腥提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

盐渍海带： 新鲜海带用35%的食盐盐渍24 h后，于-20 ℃速冻保藏所得。 由福建省红太阳精品有限公司提供。

菌种： 副干酪乳杆菌副干酪亚种R37（Lactobacillus paracasei subsp. paracasei）和酿酒酵母J4（Saccharomyces cerevisia）均由福建省农业科学院农产品（食品）加工重点实验室提供。

1.2 仪器与设备

BS110S 电子天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；数显恒温水浴锅，常州国华电器有限公司；气相色谱-质谱联用仪，岛津科技有限公司；色谱柱为DB-5 毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），SPME 手动进样手柄及固定搭载装置 50/30 μm DVB/CAR/PDMS 萃取头，安捷伦科技有限公司；20 mL 顶空进样瓶，美国Supelco 公司；氨基酸自动分析仪，苏州华美辰仪器设备有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 培养基制备 LH18 培养基[13]：蛋白胨1.5%，牛肉膏1.0%，葡萄糖2.0%，酵母膏0.74%，柠檬酸二胺0.2%，硫酸镁0.036%，硫酸锰0.005%，吐温-80 0.1%，番茄汁10%，苹果酸钠2%，调整pH 5.5±0.2，121 ℃高压灭菌20 min。

糖蜜培养基： 将甘蔗糖蜜用净水搅拌稀释至可溶性固形物至5%， 添加1%左右的柠檬酸调节pH 至5.0±0.2，115 ℃高压灭菌30 min。

1.3.2 种子液制备 供试乳酸菌和酵母菌经活化后， 分别接种于液体培养基LH18 和糖蜜培养基中， 分别培养24 和18 h 后至菌量达109和108CFU/mL，采用3 000 r/min、4 ℃离心10 min，取菌坭加等体积无菌水振荡悬浮，待用。

1.3.3 样品制备 海带经清洗脱盐、切条称重，将糖盐水（3%食盐、3%蔗糖）体积与海带质量以1∶1的比例加入经臭氧灭菌后的泡菜坛中， 按试验设计接入1.3.1 节活化好的菌株（见表1），饱和食盐水封口后于（32±1）℃下发酵8 d。

表1 发酵海带试验设计Table 1 Experimental design of fermented kelp

1.3.4 挥发性风味物质测定

1.3.4.1 固相微萃取（SPME）取样 取海带样品4 g 置于20 mL 的顶空进样瓶中进行萃取。 萃取条件：萃取头老化温度250 ℃；老化时间15 min；平衡温度60 ℃； 平衡时间30 min；250 ℃解吸附3 min。

1.3.4.2 GC-MS 分析条件 GC 条件：DB-5MS（30 m×0.25 mm，膜厚0.25 μm）；采用程序升温方式，起始温度50 ℃，保持3 min，以10 ℃/min 的速率上升至90 ℃，保持5 min，以10 ℃/min 的速率上升至230 ℃，保持2 min；以20 ℃/min 的速率上升至280 ℃，保持5 min；载气为He，流速1.0 mL/min；不分流进样。

MS 条件：电子电离源；电子能量70 eV；离子源温度230 ℃；质量扫描范围m/z 35～550；发射电流100 μA。

1.3.5 感官评价 采用定量描述感官评价法[14-16]，邀请10 位经过培训的感官评定分析员组成评价小组，将搜集到的描述词整理总结后，用M 值法首次筛选。提供给评价员一系列有差别的样品，对使用的每一描述词要求评价员在标度“0～5”的范围内标出评价位置，来判断感受到的强度。以藻腥味为例，定量描述分析评分图如图1 所示。根据感官评定小组成员实际的评价情况删除M 值较低的描述词[17]。

参考感官剖面分析法计算M 值，公式如下：

式中：F——描述词实际被述及的次数占该描述词所有可能被述及总次数的百分率/%；I——评价小组实际给出的一个描述词的强度和占该描述词最大可能所得强度的百分率/%。

最终整理出的气味感官描述词分别是藻腥味、泥土味、乳酸味、水果味、酒精味、花香味。

图1 定量描述分析评分图Fig.1 Quantitative description analysis diagram of earthy

1.4 数据处理

1.4.1 GC-MS 数据分析 对不同海带样品挥发性物质的定性分析主要采用GC-MS 联用仪NIST 14 谱库对照，选择相似度大于80%的物质，另外结合保留指数（retention index，RI）进行确定。按公式（2）计算RI：

式中：n 和n+1——分别为未知物流出前、后正构烷烃碳原子数；tn+1和tn——正构烷烃的保留时间/min；tr——未知物的保留时间/min（tn＜tr＜tn+1）。

采用面积归一化法进行定量分析， 求得各挥发性成分的相对含量。

1.4.2 其它数据分析 利用OriginLab 9.0 软件进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 海带感官风味评价

海带原料经发酵处理都可达到脱除腥味的效果，但不同微生物发酵处理，其效果产生差异，见图2。 经副干酪乳杆菌副干酪亚种R37 和酿酒酵母J4 单菌发酵都可明显脱除藻腥味，前者具有典型的乳酸发酵香，后者具有酵母发酵的醇香、水果香、花香。以副干酪乳杆菌副干酪亚种R37 及酿酒酵母J4 组合发酵处理后， 海带的腥臭味最弱，乳酸发酵香、果香及花香协调，香味愉悦。

图2 海带感官剖面图Fig.2 The sensory section of the kelp

2.2 海带挥发性风味物质组分种类间的比较分析

CK 组和3 组发酵处理海带的挥发性风味化合物的种类和相对含量的差异如图3 和图4 所示。 与CK 组相比，R37 发酵组的醇类、醛类、酮类和酸类化合物物质种类和相对含量均增加， 烃类和酯类化合物物质种类未变化，但相对含量减少；J4 组海带醇类、醛类、酸类和其它类化合物物质种类和相对含量均增加，烃类、酮类和酯类化合物物质种类增加， 但相对含量下降；R37+J4 组海带醇类、醛类、酯类和酸类化合物物质种类和相对含量均增加，烃类和酮类化合物物质种类增加，但相对含量下降。不同发酵处理间，以R37 发酵组海带醛类、 酮类化合物物质相对含量最高；J4 组海带酯类、醛类化合物物质种类最多；R37+J4 组的烃类、醛类、酯类、酸类化合物物质种类最多，醇类、酯类、酸类化合物物质相对含量最高，酮类化合物物质种类和相对含量最低。 正由于这些风味物质种类及相对含量的差异构成了不同的发酵风味和脱腥效果。

2.3 海带挥发性风味物质的消长分析

2.3.1 烃类化合物 海带经发酵后， 具有藻腥味的碘代辛烷相对含量明显下降，1，3-辛二烯、正碘庚烷未检出，E，Z-3-亚乙基环己烯、3-甲基-6-（1-甲基乙烯基）-环己烯、3-乙基-2-甲基-1.3 己二烯、正十六烷也明显下降。 经酿酒酵母J4 发酵可产生风味物质1，2-二甲基-环辛烯、1-亚甲基螺[4.4]壬烷，而副干酪乳杆菌副干酪亚种R37 发酵产生风味物质2-甲基-6-亚甲基-2-辛烯、反式-1，1，3，4-四甲基-环戊烷、3-环氧乙烷基-7-氧杂双环[4.1.0]庚烷。 烯烃和芳香烃阈值较低，可赋予海带特殊香气[18]。

图3 海带挥发性风味物质种类对比Fig.3 Comparison of the species of volatile flavor components in kelp

2.3.2 醇类化合物 海带中具有泥土味、 油脂气息的正壬醇经发酵后消失，具有蜂蜜味、花香味的β-苯乙醇在海带经酿酒酵母J4 发酵后产生，而2，6-二甲基-1，7-辛二烯-3-醇、（2Z）-3-戊基-2，4-戊二烯-1-醇和具有脂肪味、 紫罗兰香的E-2-壬烯-1-醇在海带经副干酪乳杆菌副干酪亚种R37发酵后产生，它们分别是酿酒酵母J4 和副干酪乳杆菌副干酪亚种R37 发酵产生的特征醇类风味物质。 此外，海带经发酵后又多检出了2-乙基-2-己烯-1-醇和具有柠檬味、花香味的正辛醇。

2.3.3 醛类化合物 海带中具有鱼腥味的正庚醛经发酵后含量降低，而新增了5 种醛类化合物。其中，具有脂香、清香味的（E，E）-2，4-庚二烯醛、亚麻油香的Z-2-庚烯醛和水果味的E-2-癸烯醛经副干酪乳杆菌副干酪亚种R37 发酵后含量明显增加， 是副干酪乳杆菌副干酪亚种R37 的特征醛类风味物质。具有果香、芳香味的桃醛和鸡肉香味的E-2-辛烯醛经酿酒酵母J4 发酵后含量明显增加，是酿酒酵母J4 的特征醛类风味物质。 此外，海带经发酵后又新增正辛醛、反-4，5-环氧基-（E）-2-癸烯醛、十二醛。

2.3.4 酮类化合物 海带中3-乙酰-2-辛酮经发酵后未检出，新增了5 种酮类物质，其中E-3-壬烯-2-酮、4-羟基-3-甲基-2-（2-丙烯基）-2-环戊烯-1-酮在发酵组中均有检出； 具有坚果味的3-辛烯-2-酮，牛奶味、甜香味的2-壬酮仅在R37 组检出，具有柏木、覆盆子香气的β-紫罗酮经副干酪乳杆菌副干酪亚种R37 发酵后含量明显增加，是副干酪乳杆菌副干酪亚种R37 的特征酮类风味物质。 2，6-二（叔丁基）-4-羟基-4-甲基-2，5-环己二烯-1-酮在J4 和R37+J4 组检出，是酿酒酵母J4 的特征酮类风味物质。

图4 海带挥发性风味物质组分相对含量对比Fig.4 Comparison of the relative content of volatile flavor components in kelp

2.3.5 酯类化合物 海带发酵后丁酸己酯、 十四酸异丙酯未检出，但新增了5 种酯类化合物。其中1-甲基-2-氧代环己基-3-烯羧酸甲酯和具有果香、椰子香味的癸酸乙酯在发酵组中均有检出；乙酸苯乙酯具有甜蜜香，月桂酸乙酯具有花果香，十四酸乙酯具有鸢尾油香、油脂香，在J4、R37+J4 组海带中都有检出；是酿酒酵母J4 的特征酯类风味物质；这些物质对海带良好风味均具有很大贡献。

2.3.6 酸类化合物 海带发酵后新增了3 种酸类化合物。 其中癸酸、 辛酸在J4 和R37+J4 组中检出，是酿酒酵母J4 的特征酸类风味物质。 豆蔻酸在R37、R37+J4 组检出， 是副干酪乳杆菌副干酪亚种R37 的特征酸类风味物质。 这些酸普遍具有酸臭味，对海带的发酵味具有一定的作用。

2.3.7 其它类化合物 本试验中， 其它类化合物包括2-戊基呋喃和苯并噻唑，2-戊基呋喃具有豆香味、青草味，经酿酒酵母J4 发酵后明显增加，对发酵海带的风味形成具有重要影响。

3 讨论与结论

海带腥味成分复杂， 一般是由多种物质共同作用导致的， 主要由2-丁烯醛、2-己烯醛、1-辛烯-3-醇、己醛、反-2-辛烯醛、反-2-癸烯醛、碘代辛烷等物质组成，其组成会因海带的品种、生产季节与区位、加工与保藏方法的不同而有所差异。陈婉珠等[22]通过DB-l 色谱柱检测脱盐海带匀浆液，认为2-羟基-2-对甲氧苯基-3-羧基-3-甲基丁烷、十四烷酸、十六烷酸、十八烷酸、乙酸、二恶二硅代烷、碘代辛烷、愈创蓝油烃、腈基十六烷等羧酸类、 烷烃类及芳香环基类共同形成了海带特殊的藻腥味。 刘智禹[23]通过DB-WAX 色谱柱检测福建省干海带的挥发性风味物质， 认为2-丁烯醛、2-己烯醛、1-辛烯-3-醇等化合物对海带藻腥味有一定贡献。崔晨茜等[24]通过VOCOL 色谱柱初步探究认为己醛、反-2-辛烯醛、反-2-癸烯醛及1-辛烯-3-醇对生鲜海带腥味的形成起一定作用。本试验通过DB-5 色谱柱检测经热烫、预腌脱水、冷冻保藏海带的挥发性风味物质， 认为1，3-辛二烯、E，Z-3-亚乙基环己烯、正壬醇、正庚醛、碘代辛烷、1-辛烯-3-醇、1-辛烯-3-酮、E-2-辛烯醇对海带藻腥味的形成起主要作用。可见，对海带腥味起主要作用的物质因预处理方式和检测所用色谱柱不同而结果不同[25]。

表2 海带挥发性风味物质HS-SPME-GC-MS 分析结果Table 2 Analysis of volatile flavor components in kelp by HS-SPME-GC-MS

（续表2）

（续表2）

海带经微生物发酵后形成的风味物质， 主要是由菌种及其产生的酶类分解、代谢基质中的糖、脂肪、蛋白质及烃、醇、酮、醛、酯等一系列生物化学过程而形成的[26-28]。 微生物发酵的脱腥作用，主要是通过微生物代谢对腥味物质实现生物转化以及产生愉快风味物质， 以达到消除或掩蔽腥味效果，乳酸菌及酵母菌都有良好的生物脱腥作用，由于不同微生物代谢的底物及产物不同， 其发酵后的脱腥效果及风味也存在差异[29]。 在本试验中，海带经副干酪乳杆菌副干酪亚种R37 和酿酒酵母J4 发酵后1，3-辛二烯、E，Z-3-亚乙基环己烯、正壬醇、正庚醛、碘代辛烷等腥味物质经微生物转化利用，其相对含量明显下降或未检出，产生了次生代谢产物，如：β-苯乙醇、桃醛、十四酸乙酯、十二醛、E-2-壬烯-1-醇等， 这些物质大多具有果香味，对发酵海带风味的形成具有很大贡献。而海带经酿酒酵母J4 和副干酪乳杆菌副干酪亚种R37发酵后产生的风味不同， 副干酪乳杆菌副干酪亚种R37 的代谢产物是Z-2-庚烯醛、E-2-癸烯醛、E-2-壬烯-1-醇、β-紫罗酮、2-壬酮等， 酿酒酵母J4 的代谢产物是β-苯乙醇、桃醛、十四酸乙酯、E-2-辛烯醛等，组合后风味更柔和，更协调。 酿酒酵母J4 和副干酪乳杆菌副干酪亚种R37 组合的效果不论在感官还是风味上都优于单菌发酵， 这是因为组合生物发酵代谢所利用的底物面宽和产生的产物更丰富。 因此，进行海带的生物发酵脱腥，选择适宜的微生物菌种是关键。