甜玉米蔗糖合成酶基因ZmSus6和ZmSus7的克隆及组织表达特异性检测

陈慧敏 李敏慧 冯送联 杨泉女 上官国莲 钟希琼 李国强 汪跃华 王蕴波 吴富旺

摘要：【目的】克隆甜玉米蔗糖合成酶（Sus）基因ZmSus6和ZmSus7，并进行生物信息学分析及组织表达特异性检测，为深入研究其在甜玉米生长发育和品质形成过程中的调控机制提供理论参考。【方法】以甜玉米品种佛甜10号为材料，采用RT-PCR克隆ZmSus6和ZmSus7基因，通过ProtParam、SOPMA、SignalP 4.0 Server等进行生物信息学分析，利用MEGA 6.0构建系统发育进化树，并采用实时荧光定量PCR检测其组织表达特异性。【结果】ZmSus6和ZmSus7基因的开放阅读框（ORF）长度分别为2550和2574 bp，编码849和857个氨基酸残基，对应的蛋白分子量为96.27和97.79 kD，理论等电点为7.63和8.19，均无信号肽和跨膜区域，二级结构以α-螺旋为主。ZmSus6蛋白为不稳定的亲水性蛋白，定位于叶绿体或线粒体;ZmSus7蛋白为稳定的亲水性蛋白，定位于细胞质中。ZmSus6和ZmSus7蛋白归属于PLN00142家族（Sus超级家族），具有Sus和糖基转移酶的两个功能域，分别与高粱SbSus6和SbSus7蛋白的氨基酸序列同源性最高，其同源性对应为88.44%和96.62%，归属為单子叶植物III型Sus基因家族。ZmSus6和ZmSus7基因在甜玉米的根、茎、叶、玉米芯和籽粒中均有表达，但存在显著差异（P<0.05），分别以叶和根中的相对表达量最高。【结论】ZmSus6和ZmSus7基因具有一定的组织表达特异性，可能在甜玉米生长发育和品质形成过程中发挥重要作用。

关键词： 甜玉米;蔗糖合成酶;基因克隆;生物信息学;基因表达

中图分类号： S513.035.3                              文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2020）05-1098-10

Abstract：【Objective】To lay the foundation for further revealing role of genes ZmSus6 and ZmSus7 in sweet corn growth and quality formation， the sucrose synthase（Sus） genes ZmSus6 and ZmSus7 of sweet corn were cloned， and their bioinformatics and tissue expression specificity were analyzed. 【Method】RT-PCR was applied to clone ZmSus6 and ZmSus7 genes from sweet corn variety Fotian No. 10， then their biological information was analyzed by ProtParam，SOPMA，SignalP 4.0 Server，the phylogenetic tree was established using MEGA 6.0， and the tissue expression specificity was detected by real-time fluorescent quantitative PCR. 【Results】The open reading frames（ORF） of ZmSus6 and ZmSus7 genes were 2550 and 2574 bp，encoding 849 and 857 amino acids residues，with molecular weights of 96.27 and 97.79 kD，and theoretical isoelectric points（pI） of 7.63 and 8.19，respectively. In addiction，both of protein peptide chains had no signal peptide or obvious transmembrane region，and the secondary structure were mainly α-helix. Stability prediction indicated that SbSus6 was an unstable hydrophilicprotein but ZmSus7 was stable hydrophilic protein. Subcellular localization prediction showed ZmSus6 might locate in the chloroplast or mitochondria，while ZmSus7 in the cytoplasm. Domain ana-lysis suggested both ZmSus6 and ZmSus7 belonged to PLN00142 family（Sus superfamily） including Sus and glycosyltransferase fuctional domains. Moreover，amino acid sequence alignment showed that ZmSus6 had highest homology with SbSus6（88.44%） protein of Sorghum bicolor，while ZmSus7 had the highest homology（96.62%） with SbSus7 of S. bico-lor，respectively，and assigned to the monocotyledonous type III Sus gene family. Finally，the ZmSus6 and ZmSus7 genes widely expressed in root，stem，leaf，cob and kernel of sweet corn with significant differences（P<0.05），but the highest expressions of ZmSus6 and ZmSus7 genes  were in leaves and root tissues respectively. 【Conclusion】The ZmSus6 and ZmSus7 genes have certain tissue specificity expression，and their encoded proteins may play an important role in the growth and quality formation of sweet corn.

Key words： sweet corn; sucrose synthase; gene cloning; bioinformatics analysis; gene expression

Foundation item： National Natural Science Foundation of China for Youth（31701670）; Key Area Research and Development Program of Guangdong（2018B020202008）; Scientific and Technological Innovation Platform of Fresh Food Storage and Processing Construction Project of Foshan（2015AG10011）

0 引言

【研究意义】甜玉米（Zea mays L. saccharata Sturt）為玉米属中的甜质类型，原产于美洲，也称为果蔬玉米或水果玉米。我国华南地区是甜玉米的主产区和主要消费区，在国家农业经济中发挥重要作用。植物生长发育、成熟衰老等过程所需的能量主要来源于糖代谢，包括糖类的积累、运输及转化等。当植物遭遇低温、干旱和盐碱等极端条件时，蔗糖的积累不仅有利于维持植物细胞膜稳定性，避免蛋白降解，还能在遭受环境胁迫后为植物代谢过程提供能量来源（Yang et al.，2001;Strand et al.，2003;吕文远等，2018）。蔗糖合成酶（Sucrose synthase，Sus）作为蔗糖代谢过程中的关键酶，负责调控植物不同组织中细胞壁成分或淀粉合成，与植物生长发育过程密切相关。因此，克隆甜玉米Sus基因并检测其组织表达特异性对了解甜玉米糖类代谢及其品质形成具有重要意义。【前人研究进展】目前，已在甜玉米抗逆胁迫、生长发育、分子杂交育种等方面开展大量研究工作（林婕等，2018;Baseggio et al.，2019;李余良等，2019;Yang et al.，2019），但对甜玉米品质形成和成熟衰老过程仍缺乏深层次的认识，尤其是关于Sus基因家族在糖分代谢中作用的研究报道较少。Hardin和Huber（2004）研究表明，在玉米叶片中的Sus可通过磷酸化修饰选择性地激活蔗糖水解酶活性，从而增强其对底物的亲和性。Wei等（2017）研究表明，低温贮藏能增强枇杷中的蔗糖磷酸合成酶（Sucrose phosphate synthase，SPS）和Sus活性，提高果糖含量，从而增强果实抗冷性，维持果实的外观品质。Zhu等（2017）研究发现，糖类含量（蔗糖）与果实品质密切相关，而Sus活性能直接影响果实中蔗糖的积累水平。赵云等（2018）研究发现，开花后高温处理能抑制小麦籽粒的Sus活性，从而影响籽粒中淀粉的累积。Moshchenskayaa等（2019）研究发现，植物的Sus活性不仅受大气、pH、温度、土壤湿度及肥料等外界环境因素的影响，还受基因表达水平和翻译后水平调控的影响。Liu等（2018）研究发现，ERF72转录因子（Ethylene-responsive factor）通过负调控Sus1基因表达，从而影响木薯根茎中淀粉的积累。此外，大量研究表明，植物组织中存在不同活性的Sus同工酶，其基因表达也可能具有生长发育特异性和组织特异性。自第一个Sus基因（ZmSH1，Shrunken1）从玉米中克隆后，大量Sus基因家族成员被发现，且不同物种中Sus基因家族成员的数量不同。如拟南芥（Baud et al.，2004）、桃（Zhang et al.，2015）和水稻（Fan et al.，2019）等植物中含有6～10个Sus基因家族成员，而在白杨（An et al.，2014）、烟草（Wang et al.，2015）、苹果（Tong et al.，2018）和中华梨（Abdullah et al.，2018）等植物中含有较多数量的Sus基因家族成员，分别为11、15、14和30个。通过NCBI数据库比对发现，在玉米基因组中存在5个Sus基因家族成员，其中ZmSH1、ZmSus1和ZmSus3基因已被成功克隆，且其表达模式也已明确（Hardin and Huber，2004;Duncan et al.，2006）。【本研究切入点】目前，尚未见有关ZmSus6和ZmSus7基因克隆及组织表达特异性的研究报道。【拟解决的关键问题】以甜玉米品种佛甜10号的根、茎、叶和果穗为材料，利用RT-PCR克隆ZmSus6和ZmSus7基因，对其进行生物信息学分析，并利用实时荧光定量PCR分析其组织表达特异性，为深入探究二者对甜玉米糖类代谢的调控机制提供理论参考。

1 材料与方法

1. 1 试验材料

供试甜玉米品种佛甜10号种植于广东省佛山市南海区颜峰社区试验地。RNA提取所需试剂如脱氧胆酸钠、蛋白酶K、Tris、SDS、DTT和无水乙醇等购自广州鼎国生物技术有限公司;硼酸钠十水、EGTA、氯化锂、醋酸钾和氯化钾等购自Sigma-Aldrich公司;基因克隆及表达分析的主要试剂为TranTaq? DNA Polymerase High Fidelity（HiFi）、EasyTaq? PCR SuperMix、pEASY-T1载体、TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix和Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell等，均购自北京全式金生物技术有限公司;DL5000 DNA Marker和TB Green? Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）等购自宝日医生物技术（北京）有限公司;DNA凝胶回收试剂盒购自广州艾基生物技术有限公司。

1. 2 试验方法

1. 2. 1 样品采集 甜玉米授粉后24 d植株生长状态较佳，籽粒可溶性糖含量较高，为最佳采收期，此时取玉米芯、籽粒、根、茎和叶等组织，分别用液氮快速冻存，30 min内转移至实验室进行后续试验。

1. 2. 2 总RNA提取及cDNA合成 参照改良的热硼酸法（Wan and Wilkins，1994）提取佛甜10号不同组织的总RNA，用1.2%琼脂糖凝胶甲醛变性电泳进行检测，并利用Nanodrop微量分光光度计检测其浓度。参照TransScript? One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix试剂盒说明反转录合成cDNA。

1. 2. 3 基因克隆及阳性克隆鉴定 从NCBI数据库搜索玉米Sus基因序列信息，得到2个Sus注释基因即Sus6（XM_008680885.2）和Sus7（XM_008646897.3）。根据二者的核苷酸序列，利用Primer 5.0设计特异引物（表1）。参照TransTaq? DNA Polymerase High Fidelity（HiFi）说明克隆ZmSus6和ZmSus7基因全长序列。其反应体系50.0 μL：10×TansTaq? HiFi Buffer I 5.0 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4.0 μL，10 μmol/L上、下游引物各3.0 μL，cDNA模板20 ng，TransTag? HiFi DNA Polymerase 0.3 μL，灭菌超纯水补足至50.0 μL。扩增程序：95 ℃预变性3 min;95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 150 s，进行30个循环;72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，利用DNA凝胶回收试剂盒切胶回收目的片段，将其连接至pEASY--T1载体，再转化Trans1-T1感受态细胞，用氨苄青霉素抗性平板筛选阳性克隆，挑取单菌落进行PCR鉴定，并通过测序验证阳性克隆。

1. 2. 4 生物信息学分析 将基因测序结果提交至NCBI数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）进行BLAST比对。采用DNAMAN 8.0对基因编码的氨基酸序列进行多重比对，并利用MEGA 6.0构建系统发育进化树。通过ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）在线预测编码蛋白的理化性质;利用SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）在线分析蛋白的二级结构;通过SignalP 4.0 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.0/）在线预测蛋白的信号肽;利用TMHMM Server V.2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）预测蛋白的跨膜结构;采用Wolf Psort（https：//wolfpsort.hgc.jp/）进行亚细胞定位。

1. 2. 5 实时荧光定量PCR检测 根据测序结果，利用Primer 5.0设计实时荧光定量PCR特异引物（表1）。利用TB Green? Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）熒光定量PCR试剂盒，以玉米微管蛋白基因（TUB）为内参基因，在ABI 7500荧光定量PCR仪系统进行目标基因表达量检测（Galli et al.，2013）。其反应体系20.0 μL：TB Green? Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）（2×） 10.0 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.4 μL，ROX Reference dye II（50×） 0.4 μL，cDNA模板20 ng，灭菌超纯水补足至20.0 μL。扩增程序：95 ℃预变性5 min;95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，进行40个循环。每个样品重复3次。

1. 3 统计分析

用2-ΔΔCt法计算基因相对表达量，并使用SPSS 19.0进行显著性分析。其中，根部的基因相对表达量设定为1，其他组织的基因相对表达量为3个重复样品的平均值，用最小显著差异法（LSD）进行多重比较分析。

2 结果与分析

2. 1 总RNA提取结果

由图1可知，28S和18S RNA条带清晰，说明RNA的提取质量较优。各组织RNA样品的OD260/OD280为1.9～2.1，说明RNA纯度较高，可用于cDNA合成。

2. 2 ZmSus6和ZmSus7基因克隆及测序结果

以甜玉米叶片组织cDNA为模板，PCR扩增ZmSus6和ZmSus7基因，结果（图2）显示，扩增产物约为2500和2600 bp，与预期结果相符。测序结果显示，ZmSus6基因的开放阅读框（ORF）为2550 bp，编码849个氨基酸残基;ZmSus7基因的ORF为2574 bp，编码857个氨基酸残基。

2. 3 ZmSus6和ZmSus7蛋白序列分析结果

由图3可知，ZmSus6和ZmSus7蛋白归属于PLN00142家族（Sus超级家族），具有Sus和糖基转移酶的两个功能域。由图4可知，ZmSus6和ZmSus7蛋白的氨基酸序列高度保守，其中，ZmSus6与高粱SbSus6（XP_021315397.1）的同源性最高，为88.44%，其次为黍（XP_025799116.1），为80.66%。非保守序列主要位于N端。由图5可知，ZmSus7与高粱SbSus7（XP_021305179.1）的同源性最高，为96.62%，其次为小米（XP_004966535.2），为95.10%，非保守序列主要位于C端。可见，甜玉米和高粱的Sus蛋白亲缘关系最近，与黍和小米的Sus蛋白亲缘关系次之。由图6可知，ZmSus6和ZmSus7蛋白归属于单子叶植物III型Sus基因家族，二者的亲缘关系较近，而ZmSH1和ZmSus1属于单子叶植物I型Sus基因家族，ZmSus3属于单子叶植物II型Sus基因家族。

2. 4 ZmSus6和ZmSus7蛋白理化性质分析结果

ZmSus6蛋白分子式为C4302H6721N1189O1253S35，分子量为96.27 kD，理论等电点为7.63，不稳定系数46.24（≤40为稳定蛋白），为不稳定蛋白;ZmSus7蛋白分子式C4393H6896N1176O1286S32，分子量为97.79 kD，理论等电点为8.19，不稳定系数34.91，为稳定蛋白。其次，ZmSus6和ZmSus7亲水性平均系数分别为-0.339和-0.403，推测二者为亲水性蛋白。此外，ZmSus6和ZmSus7的肽链中亮氨酸（Leu）含量较高，分别为10.4%和10.0%，其他种类的氨基酸含量均小于10.0%。

2. 5 ZmSus6和ZmSus7蛋白信号肽预测结果

通过SignalP 4.0 Server在线预测ZmSus6和ZmSus7蛋白的信号肽，结果如图7所示，ZmSus6和ZmSus7蛋白的C、S及Y值的平均值均小于0.2，推测二者无信号肽。

2. 6 ZmSus6和ZmSus7蛋白跨膜结构预测结果

利用TMHMM Server V.2.0对ZmSus6和ZmSus7蛋白进行跨膜结构预测，结果（图8）显示，ZmSus6和ZmSus7蛋白肽链均不在细胞生物膜上，无明显跨膜区域，说明二者为非跨膜蛋白（非分泌蛋白），可能存在于细胞器基质中。

2. 7 ZmSus6和ZmSus7蛋白二级结构预测结果

通过SOPMA对ZmSus6和ZmSus7蛋白进行二级结构分析，结果如图9所示。ZmSus6和ZmSus7蛋白的二级结构均以α-螺旋为主，分别占50.88%和52.04%，其次为无规则卷曲，分别占30.51%和27.77%，延伸链结构分别占12.01%和13.07%;β-折叠结构的比例最少，分别占6.60%和7.12%。

2. 8 ZmSus6和ZmSus7蛋白亚细胞定位预测结果

利用Wolf Psort对ZmSus6和ZmSus7蛋白进行亚细胞定位预测，结果显示，ZmSus6可能定位于叶绿体或线粒体，而ZmSus7可能定位于细胞质中。

2. 9 实时荧光定量PCR检测结果

以玉米TUB作为内参基因，实时荧光定量PCR检测ZmSus6和ZmSus7基因在不同组织器官中的表达情况，结果（图10）显示，ZmSus6和ZmSus7基因在根、茎、叶、玉米芯和籽粒中均有表达，但存在显著差异（P<0.05），二者均在根和叶中的相对表达量较高，但不同的是，ZmSus6基因在叶中的相对表达量最高，而ZmSus7基因在根中的相对表达量最高。

3 讨论

植物糖分含量变化主要是由蔗糖转化及淀粉合成引起。Sus作为一种可逆酶，既可催化蔗糖合成又可催化蔗糖分解。至今，已先后从马铃薯、甜菜、白杨、拟南芥、烟草、水稻、苹果、梨、桃和甘蔗等植物中成功克隆多个Sus基因家族成员，研究发现高等植物SuS基因家族可分为Sus I、Sus II和Sus Ⅲ 3个亚家族，而每个亚家族又可分为单子叶组和双子叶组（Stein and Granot，2019）。本研究从甜玉米品种佛甜10号中克隆获得ZmSus6和ZmSus7基因，分别编码849和857个氨基酸残基，与高粱和小米等物种具有较高的同源性，在不同物种间具有较高的保守性，归属于单子叶植物III型Sus基因家族。目前，在水稻和玉米等模式植物中，Sus I和Sus II基因亚家族已广泛报道，但有关Sus III亚家族基因的生物学功能仍缺乏深入研究（Brzin et al.，2011;Fan et al.，2019）。前人研究发现，不同基因家族成员在植物生长发育过程中发挥不同的生理作用（Wei et al.，2014）。本研究的生物信息学分析结果表明，ZmSus6和ZmSus7蛋白二级结构均以α-螺旋为主，不具信号肽，为非分泌蛋白，但不同的是：ZmSus6蛋白为不稳定的亲水性蛋白，可能定位于叶绿体或线粒体中;ZmSus7为稳定的亲水性蛋白，可能定位于细胞质中。由此推测，ZmSus6和ZmSus7基因发挥不同的生理调控功能，也与Sus I和Sus II基因亚家族成员（ZmSH1、ZmSus1和ZmSus3）间存在明显的功能差异有关。

Sus基因家族中不同成员间不仅在基因调控上存在差异，在基因表达上也具有生长发育和组织表达特异性（Wang et al.，2015）。在拟南芥中，Sus基因家族不同成员能受到不同外界条件的诱导，其中，厌氧条件可诱导Sus1和Sus4基因表达，水分胁迫则诱导Sus3基因在不同组织中表达，Sus2基因在开花后12 d特异性表达，可作为种子成熟的标记基因，而Sus5和Sus6基因是组成型表达（Baud et al.，2004）。同一基因在不同物种中的功能也存在差异，如Sus7基因在水稻的根、花和未成熟种子中能大量表达（Cho et al.，2011），在甘蔗中则作为管家基因组成型表达（Thirugnanasambandam et al.，2019）。在玉米中，Sus1基因在根、茎和叶中表达，为淀粉合成提供前体，Sus3基因则在胚乳、胚珠、幼芽和根中表達，而SH1基因在玉米胚乳中特异表达，影响纤维素的合成（Hardin and Huber，2004;Duncan et al.，2006）。本研究的实时荧光定量PCR检测结果显示，ZmSus6和ZmSus7基因在根、茎、叶、玉米芯和籽粒中均有表达，但ZmSus6基因在叶中的相对表达量最高，而ZmSus7基因在根中的相对表达量最高。由此推测，ZmSus6和ZmSus7基因与甜玉米Sus I和Sus II基因亚家族成员（ZmSH1、ZmSus1和ZmSus3）可能存在不同的表达模式，参与不同的生长发育过程。

此外，本研究中ZmSus6和ZmSus7基因在根和葉中的相对表达量较高，尤其是ZmSus7基因在根中的相对表达量最高，说明二者具有较强的组织表达特异性。Fan等（2019）研究表明，OsSus1～OsSus6基因在水稻中超表达后，均能通过调控细胞分裂和淀粉积累从而提高谷粒的大小和重量。Fan等（2019）研究发现，黄瓜CsSus4基因表达下调可抑制其花器官和果实的生长发育。Liu等（2018）研究发现，转录因子ERF72可抑制木薯Sus1基因的表达，进而影响根茎中淀粉的积累。由此可见，Sus不仅与植物生长发育密切相关，还能影响其营养品质。因此，在今后的研究中可通过构建ZmSus6和ZmSus7超表达载体或突变体进行基因功能验证，从而揭示其参与甜玉米生长发育、品质形成等过程的分子调控机制。

4 结论

ZmSus6和ZmSus7基因具有一定的组织特异性，其编码蛋白可能在甜玉米生长发育和品质形成过程中发挥重要作用。

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（責任编辑 陈 燕）