高效毛细管电泳法测定桑黄菌丝体提取物中腺苷含量的研究

马晓颖，肖军，杨涛，吕立涛，宋艳雨

（辽宁省农业科学院食用菌研究所，辽宁省食用菌优质栽培重点实验室，辽宁沈阳110161）

桑黄是一种具有开发价值的珍贵药用真菌，除了具有传统中医理论上的药理作用外，还具有抗癌、抗肿瘤、免疫调节、保肝和抗肝硬化等功效。受生理生态的特殊性和复杂性以及外部环境条件的制约，自然界中形成的子实体非常稀少，特别是形成可用子实体需要多年，人工栽培难度较大，这给开发研究桑黄的生物活性带来一定的困难。腺苷作为一种遍布人体细胞的内源性核苷，可直接进入心肌经磷酸化生成腺苷酸，参与心肌能量代谢，同时还参与扩张冠脉血管，增加血流量，可用于治疗室上性心动过速，同时腺苷也用于合成三磷酸腺苷（ATP）、腺嘌呤、腺苷酸、阿糖腺苷的重要中间体。

目前对桑黄的成分分析主要是桑黄多糖、三帖类和黄酮类化合物，对于核苷类化合物研究很少。利用桑黄液体培养的菌丝体作为研究对象可缩短桑黄活性物质的研究周期，该文以桑黄菌丝提取物为测定目标，利用高效毛细管-二极管阵列检测来测定其中的腺苷含量，建立高效快速的腺苷含量测定方法，简单可靠，重复性好，不仅可用于桑黄菌丝体中腺苷含量的测定，对其他样品中的腺苷的定性、定量检测都有一定的参考价值。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器与试剂。P/ACE MDQ 毛细管电泳仪（美国贝克曼公司）；精密pH 计（北京泰亚赛福科技发展有限责任公司）；电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；HZQ-QX 全温振荡器（哈尔滨市东联电子技术开发有限公司）；干热消毒箱（上海精宏实验设备有限公司）；A11 高速粉碎机（德国IKA 集团）；Cascada 实验室超纯水系统（Pall corporation）微孔滤膜（孔径0.22 μm，津隆设备有限公司）。

桑黄菌种来源于辽宁省农业科学院食用菌研究所；腺苷标准品（北京奥博星生物技术有限责任公司）；Na2B4O7、H3BO3、Na2HPO4、NaH2PO4（美国amresco 生物试剂公司）；试验过程用的试剂均为分析纯和色谱纯；试验用水为超纯水。

1.1.2 试验溶液的配制。（1）缓冲液配制，称取19.07 g 硼砂于1000 mL 容量瓶中，用超纯水配成50 mmol/L 的缓冲液，再称取3.09 g 硼酸于1000 mL 容量瓶中，用硼酸将硼砂溶液pH 调成9.18；（2）对照品的配制，将腺苷配成1 mg/mL 的母液，用50%乙醇溶解。上述溶液均用0.22 μm孔径的有机滤膜滤过，超声除气，置冰箱4℃保存；（3）标准品的配制，将腺苷1 mg/mL 的母液，用缓冲液配成浓度为0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 mg/mL 的标准液，避光低温保存。

1.1.3 样品准备。将实验室保藏的桑黄菌活化接种于马铃薯蔗糖液体培养基中，25℃，180 r/min 摇床培养7 d。将发酵液过滤后，用无菌水冲洗菌丝体3 次，60℃烘干，粉碎，过100 目筛子，装在避光瓶中备用。

1.2 方法

1.2.1 检测电泳条件。电泳操作条件如下：未涂层石英毛细管（50 μm×57 cm，有效检测长度48 cm），运行缓冲液50 mmol/L，硼砂缓冲液（pH 9.18），检测波长218 nm，分离电压20 kV，温度25℃，压力0.5 psi 进样10 s，运行时间为20 min。

1.2.2 样品提取。称取烘干的桑黄菌丝体干粉1 g 放到50 mL 离心管中，加入30 mL 配制好的20%乙醇溶液，超声提取30 min，用抽滤瓶抽滤后，将上清液收集，剩余物再加入30 mL 溶剂在95℃水浴锅加热2 h，过滤后取上清液，合并两次提取液。将处理好的产物用0.22 μm 孔径的水系滤膜滤过，收集续滤液加同体积的运行缓冲液作为样品溶液。

1.2.3 特异性考察。高效毛细管电泳对桑黄菌丝提取物中腺苷的测定采用内标法，将腺苷配成10 μg/mL 加入到处理好的桑黄菌丝提取物中，将腺苷、桑黄菌丝提取物、以及桑黄菌丝提取物加腺苷分别进样。每一种样品进样5 次，观察腺苷峰附近有没有干扰峰，以此判断方法的特异性。

1.2.4 标准曲线建立。将腺苷配成1 mg/mL 的母液，根据毛细管电泳中的定量计算方法，将腺苷标准品用缓冲液配成浓度为0.05、0.1、0.2、0.5、1.0 mg/mL，分别进行进样测定。记录峰面积积分值，以对照品浓度为横坐标，以对照品峰面积为纵坐标，建立线性回归方程。

1.2.5 灵敏度测定。将适量的腺苷标准品加到桑黄菌丝提取液中，无限稀释，再分别按照1.2.3 的电泳条件进样，然后找到信噪比（S/N）为3 的来确定检测限（LOD）。

1.2.6 回收率测定。在桑黄菌丝体中测得的腺苷浓度基础上添加低、中、高浓度的标准品，按1.2.3 节的色谱条件进样测定，将腺苷的峰面积带入到标准方程中，得出的浓度再除以理论浓度，得到回收率。

1.2.7 方法的精密度和稳定性测定。取对照品溶液用缓冲液配置成0.05 mg/mL 按照1.2.3 节的色谱条件连续进样测定5 次，记录迁移时间和峰面积，计算腺苷迁移时间相对标准差（RSD）和峰面积的相对标准差（RSD）。将测定的提取好的样品，分别在室温下放置0、2、4、6、8 h 后按照1.2.3 节的色谱条件分别进样，每次3 个重复，考察腺苷在8 h 内的稳定性。

2 结果与分析

2.1 方法特异性检测结果

从图1 可以看出，腺苷的对照品9.800 min 左右时有特征峰出现，峰性稳定良好，而在桑黄菌丝体中也有相同时间的特征峰，所以表明在桑黄菌丝提取物中含有腺苷，且该方法可以用于定性和定量。

2.2 标准曲线的建立

在1.2.1 中毛细管电泳仪最佳条件下，腺苷标准品峰面积与浓度在0.05～1.00 mg/mL 范围内呈现良好的线性关系（图2）。由图3 可知，回归方程为y=1E+07x+210943，相关系数r 为0.9992，将目的峰的峰面积带入方程，得到腺苷的含量为20.2 μg/mL。

2.3 灵敏度测定结果

该试验利用标准品添加到样品中的方式来考察灵敏度。信噪比（S/N）为3 的来确定检测限（LOD），测得腺苷在桑黄菌体提取物中的LOD 为0.12 μg/mL。

2.4 加样回收试验结果

量取3 份样品，分别加入不同量的标准溶液进行测定，实测添加量与标准添加量之比为回收率，从表1 可以看出，测得腺苷回收率在88.9%～95.7%。

表1 样品中添加腺苷回收率试验结果

2.5 进样精密度和稳定性考察

取对照品溶液配置成0.05 mg/mL 连续进样测定5次，记录迁移时间和峰面积，计算腺苷迁移时间RSD 为0.33%，峰面积的RSD 为0.9%。将测定的提取好的样品，在室温下放置0、2、4、6、8 h 后分别进样，记录腺苷位置的迁移时间RSD 为0.22%，峰面积RSD 为1.82%，表明样品在8 h 内具有良好的稳定性。

3 讨论

3.1 样品提取方法确定

该试验中采用菌粉按照1∶30 加水，选取单独超声、单独高温水浴、先超声后水浴这3 种方法进行样品的提取，结果表明，单独超声和单独水浴的提取方法使得毛细管电泳的指纹图谱不完整，可能是由于提取不彻底导致，所以选择先超声后水浴的方法为最后的提取方法。

3.2 样品出峰时间讨论

毛细管电泳中样品的分离对于缓冲液的pH 有很大的影响，样品和对照品的比对应该在同一天电泳中完成。在后期的跑样中，缓冲液的酸碱性发生变化会导致总体样品分离的迁移时间向后延迟，该文中在样品后期连续5 次进样中的腺苷出峰时间与原来的出峰时间有所差异，但并不影响测量结果。